HBVDNA定量及变异检测的临床应用 经典.pptVIP

③分子信标（molecular beacon） ④light upon extention primers(LUX primers) 2.连接酶链反应（LCR） 四、HBV 基因分型 1.分型原理 全基因组序列差异=8%或S区DNA序列差异=4%定义为一个基因型，目前发现HBV存在A、B、C、D、E、F、G、H8个基因型。 2.分型方法 （1）全基因组测序 优点：准确 缺点:耗时耗力，昂贵,需要测序仪 （2）限制性片段多态性分析（RFLP） 优点:特异性高 缺点:耗时，多用于科研 （3）PCR-ELISA 生物素包被微孔，将亲和素标记的探针固定在膜上，使用生物素或地高辛标记的引物扩增目标片段，扩增产物带有标记物，产物与探针结合。相继加入抗生物素或地高辛抗体，以后同ELISA。 优点：比PCR敏感几十倍，且 可以使用不同的探针进行分型，已经有商品化试剂盒 缺点:微量的污染即可导致假阳性且需进行PCR和ELISA两步操作。 (4)反向斑点杂交 原理基本同PCR-ELISA，不同的是将探针固定在同一张膜上，操作方便，所需PCR产物的体积小，已经开始在临床上广泛应用。 （5）Real-time PCR 是目前最流行最简便的方法。原理是根据不同的突变位点设计多对引物和探针，平行扩增，实时定量检测。 优点:定量，方便 缺点：需要多个反应体系 2.临床意义 （1）不同的基因型对药物的敏感性不同， A型对普通干扰素更敏感，长效干扰素对各型的作用基本相同。 （2）临床表现及预后不同。C型多为急性或重型肝炎，预后差 （3）地区差异，我国各型均有，北方以C型为多，南方多为B型，藏族地区以D型为主 （4) 基因的变异可以导致HBsAg和HBeAg阴性 五.YMDD检测的临床应用 1.定义 HBV P区编码的DNA聚合酶基因在739或741位点发生突变，其编码的HBV逆转录酶活性部位——“酪氨酸（Y）－蛋氨酸（M）－天门冬氨酸（D）－天门冬氨酸（D）”(YMDD主型区)，变为“酪氨酸（Y）－缬氨酸（V）－天门冬氨酸（D）－天门冬氨酸（D）”（YVDD）或“酪氨酸（Y）－异亮氨酸（I）－天门冬氨酸（D）－天门冬氨酸（D）”（YVDD）导致逆转录酶亚结构发生改变，妨碍了与拉米夫定的结合，从而造成HBV对拉米夫定敏感性下降。 Val------GTG YVDD Ile-------ATT ATC YIDD ATA Met-----ATG YMDD 图12. YMDD变异原理 (wild-type) high affinity Lamivudine inhibition ss (-) DNA Y M D D 图13. Lamivudine 作用位点 Nucleotides ss (-) DNA (variant) Y V/I D D reduced affinity 图14. Lamivudine 耐药机制 拉米夫定治疗HBV感染治疗过程与YMDD变异关系 治疗过程 研究例数（例） 无变异 （YMDD） 变异 治疗前 139 106（76%） 33（24%） 9个月 37 33（89%） 4（11%） 12个月 37 25（67.5%） 12（32.4%） 18个月 16 7（43.7%） 9（56.3%） 24个月 12 4（33.3%） 8（66.7%） 引自J Virol. Metods 1999；83：181-187 2.YMDD变异检测对用药的指导意义 Lamifudine对HBV YMDD野生型的抗病毒作用优于Adefovir，而且对机体潜在副作用也小于Adefovir，所以针对携带HBV YMDD野生型患者，首选择Lamifudine。 在Lamifudine治疗过程中动态监测YMDD变异情况，一旦出现YMDD变异，改用Adefovir，这样可以持续抑制病毒变异株，第一时间就使病毒变异株就处在抑制状态。 在使用Adefovir药物治疗过程，也动态检测YMDD变异情况，防止YMDD野生株回复成优势株，一旦出现YMDD野生株成为优势株，改用Lamifudine或者联合Lamifudine和Adefovir抗HBV治疗是可取的。通过对YMDD变异的动态监测，有助于合理选择药物，长期使HBV处于低水平复制状态，甚至耗竭HBV cccDNA库，达到彻底消除HBV的目的。 3.常见检测方法 基因测序法 ELISA法 反向斑点杂交 先对YMDD区域进行扩增，