百脉根ljpp2c蛋白磷酸酶负调控mpk6信号转导途径-微生物学专业论文.docx

优秀毕业论文 精品参考文献资料 研究生优秀毕业论文 百脉根LjPP2C 百脉根LjPP2C蛋白磷酸酶负调控MPK6信号转导途径 目 录 摘 要 I Abstract ．II 缩略语表 III 一前。言 ．11 月U舌 · 1．1共生关系 l 1．1．1共生固氮的意义 ．1 1．1．2根瘤共生 ．1 1．1．3根瘤形成的机制 ．3 1．2 SymRk的结构和功能 4 1．3 MAPK信号途径 5 1．3．1植物中MAPK信号途径 5 1．3．2 SIP2的结构与功能 7 1．4 2C类蛋白磷酸酶 ．．8 1．5研究的目的和意义 一12 2材料与方法 13 2．1材料 ．．13 2．1．1质粒和菌株 1 3 2．1．2植物材料 14 2．1．3分子生物学和植物转化相关试剂 1 5 2．1．4所用培养基 15 2．2方法 ．17 2．2．1酵母双杂交筛选MPK6相互作用蛋白 17 2．2．2 B．半乳糖苷酶活性检测 21 2．2．3体外蛋白Pull—down分析蛋白质之间的相互作用 ． 22 2．2．4双分子荧光互补(BiFC)分析 26 2．2．5体外蛋白磷酸化分析 27 2．2．6表达分析 28 2．2．7亚细胞定位分析 30 万方数据 华中农业大学2015 华中农业大学2015届硕士研究生学位论文 2．2．8毛根转化和鉴定 30 3结果与分析 33 3．1诱饵质粒的构建和鉴定 ．．33 3．2百脉根AD—eDNA文库筛选 ．．34 3．3百脉根蛋白磷酸酶基因厶／P尸2C的结构分析 35 3．3．1聊2C基因的结构 ．35 3．3．2 LjPP2C进化树分析 ．．35 3．3-3植物B类PP2C进化树分析 36 3．4百脉根LjPP2C与MPK6相互作用的鉴定 ．．37 3．4．1在酵母体内验证LjPP2C和MPK6的相互作用 37 3．4．2体外蛋白pull．down验证两个蛋白的相互作用 38 3．4．2 BiFC验证两个蛋白的相互作用 ．．39 3．5百脉根LjPP2C的亚细胞定位 40 3．6百脉根巧即2C表达特性分析 41 3．7百脉根LjPP2C具有除去MPK6磷酸化的功能 ．．43 3．8巧即2C在百脉根中超量表达 44 4总结、讨论及展望 46 4．1总结 ．．46 4．2讨论 ．．46 4．3展望 ．．48 参考文献 49 附录1本实验所用引物 一58 致{射 59 万方数据 百脉根LjPP2C 百脉根LjPP2C蛋白磷酸酶负调控MPK6信号转导途径 摘 要 根瘤菌和豆科植物之间形成的根瘤共生固氮系统是自然界中植物获取氮素最环 保、经济的方式，对农业的可持续发展有重要意义。根瘤共生固氮系统的建立需要 一系列的信号途径。共生信号途径中的受体激酶SymRK和有丝分裂原激活蛋白激 酶激酶SIP2特异性的相互作用。SIP2属于MAPK信号途径中的MAPKK家族，调 节早期侵入线和根瘤原基的形成，是一个重要的早期共生信号调节子。本研究是以 SIP2的靶蛋白MPK6为研究对象，通过筛选百脉根的AD．eDNA文库，分离鉴定出 与MPK6相互作用的蛋白，主要研究结果如下： 1．从百脉根eDNA中扩增出MPK6全长基因，利用酵母菌株Y187中的报告基 因LacZ，检测MPK6的转录激活作用。结果发现MPK6在酵母系统里有自激活活性， 不能作为诱饵蛋白。通过分析MPK6的蛋白序列，构建7个缺失突变载体，并分别 检测他们的转录激活活性和D一半乳糖甘酶活性。结果表明MPK6的转录激活位点位 于362。386个氨基酸之间。 2．以含有MPK6完整激酶结构域且没有转录激活作用的MPK6卜351为诱饵筛选百 脉根AD．eDNA酵母双杂交文库，分离鉴定出一个编码2C类蛋白磷酸酶的基因，命 名为三，尸刀C。生物信息学分析显示LjPP2C属于PP2C大家族，通过蛋白序列和进 化树分析发现LjPP2C属于B类亚家族。 3．通过酵母双杂交、体外蛋白Pull—clown以及双分子荧光互补(BiFC)实验证明 MPK6全长和LjPP2C有相互作用。 4．在体外，LjPP2C能够使磷酸化的MPK6去磷酸化。 5．利用荧光定量PCR检测厶胛2C在百脉根不同组织中的表达情况。结果表明 三胛2C在百脉根的各个组织中均有表达，主要在叶和根中表达。 6．巧即2C的生物学功能。利用农杆菌介导的毛根转化技术将厶，PP2C的超表达 载体转入百脉根根中，在接种根瘤菌4周后观察百脉根的结瘤表型。实验结果表明 三胛2C在百脉根中超表达后，结瘤数会减少。 关键词：共生固氮；百脉根；MAPK级联；MPK6；2C类蛋白磷酸酶 万方数据 华中农业大学2015 华中农业大学2015届硕士研究生学位论文 Abstra ct The symbiotic interacti