感染性克隆突变体构建流程卡.docx

项目名称+实验步骤编号KB2016PRRSV-0201-DC试验名称感染性克隆突变体1试验类型预实验 对照试验产品研发试验替补试验 复核试验 目的意义验证蓝耳N糖基化位点突变对抗原免疫原性的影响研究内容1.在pUC19-PRRSV载体上突变gene1的位点12.将突变好的片段双酶切，回收，连到pWSK载体上去技术路线人员安排江雪梅进度安排pUC19-PRRSV突变体构建2016年9月12-2016年9月14日突变体测序，筛选2016年9月18日-2016年9月22日将突变体转移到pWSK载体上去206年9月24日-2016年9月30日试验材料质粒pUC19-PRRSV质粒pMD-19T-AP质粒pWSK-PRRSV引物F:CCggcgcgccagaaagggaaaatttataa引物R1:gactcacaCtccctatcccaaatatctcgggatgg引物F1:atagggaGtgtgagtcaagtttatgttgacatcaag引物R:gctgggaccatgccggccttaatt测序引物Fcx1：gcatgaccgatgtagtgagaacgat限制性内切酶AscⅠ、PacⅠT4连接酶大肠杆菌菌株：DH5α，BL21(DE3)试验方法引物F、R1以质粒pUC19-PRRSV为模板，PCR扩增片段A（1126 bp）；F1、R以质粒pUC19-PRRSV为模板，PCR扩增片段B（2411 bp）。引物F、R以片段A和片段B为模板，PCR扩增片段C（3521 bp）。用AscⅠ、PacⅠ双酶切片段C，胶回收基因片段C（3496 bp）；用AscⅠ、PacⅠ双酶切质粒pMD-19T-AP（2702 bp+15 bp），胶回收载体片段（2702 bp）。将基因片段C（3496 bp）和载体片段（2702 bp）用T4连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。提取质粒与质粒pUC19-PRRSV比较大小（一样大），酶切鉴定后送测序，测序正确的质粒即为重组质粒pUC19-突变体1。用AscⅠ、PacⅠ双酶切质粒pUC19-突变体1（3496 bp+2702 bp），胶回收3496 bp片段；用AscⅠ、PacⅠ双酶切质粒pWSK-PRRSV（约5500 bp+3496 bp），胶回收约5500 bp片段。将3496 bp片段和约5500 bp片段用T4连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。筛选重组子，重组质粒即为感染性克隆突变体1。结果汇总分析结果复核检验样品保存样品编号保存条件和数量样品保存人保存位置和日期样品理论保存时间样品详细备案执行人/日期复核人/日期执行人/日期复核人/日期执行人/日期复核人/日期制卡人发卡人接卡人执行人收卡人归档人注：制卡人指方案制定人员；发卡人指对该流程卡终审确认签字人，两人签字有效；接卡人指项目主管或助管；执行人指参与实验操作的人员；收卡人必须是部门主管或助管和发卡人共同签字；归档人由学术委员会常务委员任命二人共同负责签字。大项目命名原则：公司名称+时间+项目+发卡人（接卡人）名字首字母简称如：KB2016PRRSV-DZS子项目命名原则：公司名称+时间+项目+子项目代码+发卡人（接卡人）名字首字母简称如：KB2016PRRSV-01-DZS流程卡编号原则：公司名称+时间+项目+子项目代码+子项目中试验步骤+发卡人（接卡人）名字首字母简称，如：KB2016PRRSV-0101-DZS子项目代码需由方案初审通过后经统筹中心备案领取。