pi3k 2fakt抑制剂对肺腺癌a549细胞vegf转录及调控影响.docxVIP

华中科技大学硕士学位论文4-苯并芘、砷）等。肺癌的发生发展的机理和作用机制目前深入到基因水平，有关肺癌的致癌基因和抑癌基因的研究，目前已积累了相当多的资料。一般认为基因的异常改变是癌变的基础，英国癌症研究院的科学家通过大量的 DNA样本分析，共确定出64个基因变异体可能使一些个体容易患肺癌，这 64个 SNP中的一部分能改变被表达蛋白的结构和功能，可能与肺癌有直接关系。已经证明在肺中有几个癌基因家族表达异常，包括引起突变的 ras家族，放大基因的 myc家族、c-erbB，与凋亡相关的 bcl-2、kit以及变异的野生型抑癌基因 p53、p16和 RB等。大量的实验和临床研究证明在NSCLC中常见 ras族基因产物、c-erbB-1/2、VEGF/VEGFR及 EGFR等的过度表达和野生型 P53基因的缺失。自 20世纪 70年代，FolkmanJ教授提出肿瘤生长与血管化以来，大量的研究证实，实体肿瘤的生长、侵袭、转移等生物学行为与肿瘤内新生血管的生成重塑等相关。因此抑制肿瘤血管生长一直是肿瘤治疗的一个热门方向。VEGF/VEGFR作为目前已知最强的促肿瘤血管生成因子，对肿瘤血管的生成和肿瘤的生长起着关键性的作用。必威体育精装版的研究发现 VEGFR2与肿瘤的转移和归巢有着密切的关系。虽然在临床上以VEGF及其受体为靶点的生物治疗已在进行，如美国 FDA已批准上市的 VEGF的单抗 AVASTIN，尚在进行临床试验的 VEGF受体拮抗剂 PTK787/ZK222584等，但是对于细胞内 VEGF转录及表达的信号传导通路之间仍然了解的不是很多。调控 VEGF的信号通路有多种，如 PI3K/Ak-m TOR，Ras-Raf-MEK/MRK，e NOS/NO，IP3/Ca 2+等，而且相互之间也存在着联系，彼此互相连通，构成信号网络。本实验研究的信号通路是 PI3K/Akt-mTOR。已有的研究证实，PI3K/Akt信号通路可以调节细胞的多种生物功能生存，包括细胞的生长，凋亡，迁移，侵袭，在对 VEGF转录及表达的调控中起着重要作用。本实验希望证实通过对 PI3K/Akt信号通路某一个节点的抑制能降低VEGF的转录和表达。2华中科技大学硕士学位论文论文正文肺癌作为肿瘤一类疾病中的多发病，常见病，高危病，发病率和死亡率在全世界和我国都是占第一位的。而在肺癌中，非小细胞肺癌（ non-small cell lungcancer ,NSCLC）占到 75%～80%左右。恶性实体肿瘤在生长和转移中，血管发生起着至关重要的重用。Folkman J早在 70年代就提出了肿瘤生长与血管新生的关系，认为血管生成将是肿瘤研究治疗的一个新的领域。已有的研究证实，VEGF作为迄今为止发现的最强的促血管生成因子，在 NSCLC的发生发展过程中起着非常重要的作用。但是对其在细胞中转录和调控的信号通路不是很明确。本实验旨在通过研究PI3K/AKT抑制剂（LY294002）对肺腺癌细胞株 A549的 VEGF在转录和蛋白表达水平的调控作用，从而从一个侧面观察 VEGF在 NSCLC发展过程中的作用。1材料1.1细胞人肺腺癌细胞系 A549购自武汉大学培养物保藏中心1.2引物人 VEGF引物由上海生工生物工程公司合成，序列如下：正义链 5’ATGAACTTTCTGCTGTCTTGGG3’反义链 5’TCACCGCCTCGGCTTGTCACATC 3’扩增产物片断长为 576个 bp。内参 GAPDH是 invitrogen公司合成，序列正义链 5‘GAAGGTGAAGGTCGGAGTC3’反义链5’GAAGATGGTGATGGGATTTC3’扩增产物片断为 226个 bp。冻干粉用无菌三蒸水溶解,使其储存浓度为 25μmol/L, - 20℃储存备用。1.3主要药品和试剂RPMI 1640培养基、新生小牛血清(均为 GIBCO公司，USA)；二甲基亚砜（DMSO）、胰蛋白酶（均为 Sigma公司，USA)； TRIZol reagent (Invitrogen公司，USA)； Oligo dT、M-MLV逆转录酶（均为 Promega公司，USA）；5华中科技大学硕士学位论文dNTPs、Taq DNA聚合酶、DNA分子量标准（均为清华天为公司）；VEGFELISA试剂盒（４８孔，购自晶美公司）；琼脂糖（Espain公司）；LY294002（购自晶美公司）；其他试剂为国产分析纯。1.4主要仪器与器材PCR扩增仪（UNOⅡ型，Biometre公司，USA）；超净工作台（YJ-1450）江苏苏州净化设备公司）；二氧化碳培养箱（Shellab公司，USA）；低温高速离心机（Beckman公司，USA）；低温台式离心机（Sigma公司，USA）；可见-紫外分光光度计（U-2000，H