vegf- 2c165-对早期兔腱骨愈合影响实验研究.docxVIP

前言前交叉韧带（anterior cruciate ligament,ACL）损伤是膝关节常见外伤之一，可致关节不稳，影响关节运动功能。随着物质生活的提高，群众体育活动越来越广泛，ACL损伤的患者也逐年增多,ACL也成为常见的运动创伤之一。ACL断裂引起的膝关节不稳称 ACL缺损膝，治疗效果不理想将严重影响运动能力或丧失运动能力，晚期导致严重的膝关节病。近 20年来，交叉韧带的修复与重建技术有了明显的进步，自体结构、异体结构、人工韧带等重建交叉韧带的治疗方法都已经广泛应用于临床，特别是关节镜技术的发展对于交叉韧带的重建具有重要意义，它也成为二十世纪骨科领域除骨折内固定、人工关节置换之外的三大重要发展之一。随着关节镜的普及，ACL重建的优良率已达到 75%—90%，但仍有部分患者术后效果不佳，原因有很多，而腱骨愈合（tendon bone healing）是其中的关键因素之一。正常腱骨愈合需要经历移植物的变性、血管再生、细胞再生、胶原沉着、和基质重朔的过程[1]，其中血管再生是一个重要的环节，能决定腱骨愈合的程度，从而影响手术的成功率及 ACL重建后的稳定性。新生血管形成是个复杂的过程，与诸多因素有关，如成纤维细胞生长因子、转化生长因子、血小板衍生长因子、前列腺素 E等，有的是直接作用于血管内皮细胞，有的是间接地通过其他的辅助细胞来诱导血管生成。在诸多因素中，血管内皮生长因子(vascular endothelial factor,VEGF)是公认作用最强、特异性最高的促血管生长因子[2、3、4]，在机体的组织愈合及再生中具有重要作用。VEGF又称血管通透因子（vascular permeability factor,VPF）或促血管因子（vasculotropin，VAS），是 1989年 Ferrara等[5]首先从牛重体滤泡细胞培养分离出来的。VEGF基因定位于人类 6号染色体的 p12—p21区，全长 28kb，分子量在 34000—45000之间，是一种由亚基内及亚基间二硫键交联形成的同型二聚体糖蛋白，目前已发现 VEGF家族包括 5大成员：VEGF—A、VEGF—B、VEGF—C、VEGF—D和PGF（placental growth factor,胎盘生长因子），研究和认识最多的是 VEGF—A，分别含有 121—、145—、148—、165—、183—、189—和 206—氨基酸残基，其中 VEGF165的含量最丰富、生物作用最强，本实验中就是采用 VEGF165进行实验7研究。血管内皮细胞上广泛分布着两种特异性的 VEGF结合位点 ,它们与 VEGF的亲和力有所差异，从而使 VEGF发挥促进血管的通透性和促进新生血管生成的作用。关于 VEGF的分布，在个体胚胎发育过程中 ,VEGF就有表达 ,可能与胚胎体内血管形成有关。在成人的心脏、脑组织、肺组织、骨骼肌以及肾脏等，VEGF都有不同程度的表达，VEGF的存在可能与维持这些部位的血管正常功能有关。VEGF自发现以来，对其的研究已成为近年来组织修复和血管再生的研究热点，而 VEGF与腱骨愈合相关的研究，主要在 VEGF在腱骨愈合过程中的表达和 VEGF对腱骨愈合的影响两方面。在 VEGF在腱骨愈合时期的表达方面，Yoshikawa[6]等人对 30 只日本白鼠行 ACL 重建，发现术后 2、3 周时腱骨愈合界面中 VEGF高度表达。Boyer等人[7]以狗交叉韧带重建处行 RNA转移技术观察，发现术后 7和 10天时 VEGFmRNA处于表达曲线的峰值。在 VEGF对腱骨愈合的影响方面，Zhang等人[8]将 15只斯普拉—道来鼠为研究对象，分别将左右跟腱切断后重新修复于跟骨，将实验组和对照组腱骨愈和处分别注入 100μgVEGF和 2ml生理盐水，术后 7天及 14天时，腱骨愈合处平均最大拉断力均高于对照组。为了进一步了解 VEGF对腱骨愈合的影响，本实验将以新西兰兔为研究对象建立腱骨愈合模型，对比实验组与对照组之间的差异。8实验材料和方法1.实验动物健康新西兰兔 20只，年龄平均为 10个月，体重为 2.5—3.5kg，雌雄不限。取材前新西兰兔活动良好 ,可奔跑 ,未见关节肿胀、跛行及其他异常。2.主要试剂和器材VEGF165RGT-10微型控制万能试验机新西兰兔PBS溶液戊巴比妥钠络合碘消毒液双氧水2%盐酸利多卡因注射液不可吸收缝线（1-0、1号）数码摄像光学显微镜10%中性甲醛溶液600万像素数码相机精确度为 0.02mm的游标卡尺购自长沙生物晶美生物有限公司,由 Peprotech公司生产由南华大学数理学院提供（见图 20）由南华大学动物试验中心提供（见图 12）由南华大学附属南华医院提供由南华大学后勤中心提供天顶奇龙牌，长沙雨花消毒药有限公司天顶奇龙牌