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不结球白菜wrky转录因子cdna片段的克隆及分析
蓝苤登王直i±星【过金
1.3 RI-POR
行,以单链eDNA为模板进行PCR扩增。
-TGGCGNAARTAYGGNCARAAR-;W-2
2.0rnmol·L-1
MgCh,0.51.tmol·L.1上下游引物,1U PCR仪上进行。扩增程
Taq酶,反应在PTC.100
4C保存。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳,凝胶成像系统进行拍照及分析。
1.4 3’-eDNA末端快速扩增(RAcE)
参照李秋莉等(2002)的方法,根据已获得的白菜WRKY转录因子eDNA片段测序结果,
为53℃,PCR反应体系同上。
1.5目的片段的回收及克隆
GelDNAPurificationkit
目的片段的回收按照TaKaRa生物公司的Agarose Vet.2.0试剂盒的使
18-T载体(TaKaRa)上。连接产物转化感受态
用说明进行。回收的目的DNA片段连接到pMD
进行蓝白斑筛选。
1.6质粒的提取及重组质粒的PCR鉴定
挑取白斑接种于3ml
LB(含lOOp,g·L_1Amp)液体培养基中。37C200rpm震荡培养过夜。
参照文献【6】的方法,煮沸法提取质粒。取纯化质粒DNA1皿作为模板,用上述特异引物在相同
条件下进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳检测插入片段的大小。
1.7序列测定及分析
序YfJ钡,U定由上海博亚生物技术公司在ABI377测序仪上进行;相似性比较在NCBI站点上用
BLAST完成。
2结果与分析
2.1 不结球白菜WRKYl基因的RT-PCR扩增
进行PCR扩增,从图1中可以看出,无论是用W-I还是用W-2作为上游引物,均获得了一条约
350bp的单一条带,与预期的片段大小一致。将该片段回收,克隆至载体中,转化大肠杆菌,蓝
自斑筛选,阳性克隆经过测序,得到了两个完全相同的cDNA片段,定名为WRKYl,其长度为
348bp。
图1 不结球白菜WRKYl基因的RT-PCR产物 图23’RACE扩增结果
1.引物W-I与WRKYl8-F的扩增结果: M:DNA分子量;
2.引物W-2与WRKYl8-F的扩增结果. 1.3-RACE扩增结果
RT-PCR ofWRKYlinBrassica Theresultof3’-RACE
Fig.1 product geue Fig.2
eampestrisssp.ehlnensis. M:markerDL-2000;
M:markerDL-2000;1 1.3’.RACEPCR
PCRproductusingprimerW-1
and PCR W-2and
WRKYl8-F;2productusingprimer
、ⅣRKYl8.F
2 2 3’一cDNA末端快速扩增
根据已获得的白菜WRKYl片段测序结果,设计一条正向引物W-3
看出,获得了一200bp左右的条带,与预期的片段基本相符。将该片段回收,克隆至
载体中,转化大肠杆菌,经过蓝白斑筛选,阳性克隆的测序结果表明,该片段大小为201bp,与
菜WRKYl基因的3’末端。
2.3不结球白菜WRKYleDNA片段的序列分析
将所获得的两个片段经过拼接,获得了473bp的不结球白菜WRKYI基因的3’末端序列,推
同源性为46~60%。将该序列提交GenBank数据库,登录号为AF518555。
47
嚣墓盆王直牡班过盒
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