不结球白菜胞质雄性不育系atp6基因cdna片段的克隆及序列分析.pdfVIP

1 2方法 1．2．1 Lab 糖凝胶电泳检测提取RNA质量，电泳结束后，UVP and ImagingAnalysis System自动成像， 记录。 1．2．2 RT-PCR 扩增。根据atp6基因序列保守区设计引物s1、s2及s3、s4。(所有引物由上海博亚公司合成， 序列见表1)。 表1 不结球白菜atp6基因克隆引物 ：!!!!!!生塑!!堡!!!鲤!!竺堡!竺!!!：!!!!!!!曼!堕!!!!!!!!竖 引物PrimcB 序列5一+3 引物Primers 序列5—3 1．2．3片段的回收、克隆测序按照DNAextraction gel Kit方法回收纯化所需要的条带。条带的 克隆参照萨姆布鲁克J等的方法【13】。重组质粒通过PCR扩增检测，DNA测序工作由上海博亚公 司完成。 进行同源性比较。 2结果与分析 2．1异硫氰酸胍法提取花蕾总RNA的质量分析 28S+ 18S● 图1不结球白菜不育系花蕾总RNA电泳图谱 oftotalRNAinCMSline Fig·IEleetrophoresisprofile Chinese ofnon-heading cabbage 从图1可以看出所提取的花蕾总RNA质量较高，带型整齐一致，表明所提取的RNA降解很 5l 蕴墓盆王直挫班过金 纯度较高。 2．2不结球白菜不育系alp6基因cDNA片段克隆 2．3 匪2不结球白菜不育系ntp6基因RT-PCR产粞电泳图谱 Fig·2Electrophoresisprofile ofRT-PCRproductsofatp69eneinCMS A为引物对(Sl，S2)扩增图潜：B为引物对(s3，s4)扩增图谱 with SIand profile with S3andS4 A：amplified primer S2：B：amplifiedprofileprimer 图3重组质粒的PCR鉴定 PCR ofrecombinant Fig．3 analysis plasmid M：DL2000MolecularMarker；A：a晒l，B：“p6-2 对扩增片段l亘』收后进行克隆，经过PCR检测特异片段已经转化进火肠杆菌(图3A，13)。500bp 片段测序了5个克隆，测序结果相同，命名为alp6-1，核廿酸序列全欧为456bp，其核苷酸组成如 52 其核苷酸组成如图5。 GGAGCAC刀了CGGG彤力7CG 图4不结球白菜不育系atp6-I基因部分cDINA序列 Partial inCMS Fig·4 e