CC2aI作为异硫氰酸曙红固体基质室温磷光增强剂及其在免疫分析中的应用.pdf

Vo1．26 高 等 学校 化 学 学报 NO．1 2005年 1月 CHEMICALJOURNALOFCHINESEUNIVERSITIES 49～ 51 [研究简报] CaCI2作为异硫氰酸曙红固体基质室温磷光 增强剂及其在免疫分析中的应用 吴娅兰 ，李隆弟 ，刘佳铭z，朱国辉 (1．清华大学化学系，北京 100084；2 漳州师范学院化学系，漳州 363000) 关键词 固体基质室温磷光免疫分析法；异硫氰酸曙红；CaC1z作增强剂；人 IgG 中图分类号 0653，7 文献标识码 A 文章编号 0251—0790(2005)01—0049—03 有关荧光素的溴和碘取代物的低温磷光性质与取代度关系的研究表明[1]，随着取代度的增大，磷 光量子产率与荧光量子产率之比呈现先增大继而减小的趋势，即溴和碘的充分取代物的磷光反而减 弱，故用eosin—ITC作标记物的报道很少 ．化学结构和环境等因素对磷光发射有重要影响[3．4]；某些 已被重原子 (Br或／和I)高度取代的试剂，一旦有外重原子微扰剂存在，其磷光发射又有显著提高[5]． 故不能因为esoin—ITC是溴的充分取代物就断定它在其它条件下亦不会具有优 良的磷光发射性质．为 此，本文研究了不 同无机盐存在时esoin—ITC在聚酰胺膜上的室温磷光特性，并以测定人IgG为例，建 立了用esoin—ITC为标记物、CaC1。为增强剂的固体基质室温磷光免疫分析法(SS—RTP—IA)． 1 实验部分 1．1 仪器、试剂和溶液配制 磷光测定在 日立M850荧光分光光度计上用磷光附件完成．自制固体基 质样品架．聚酰胺膜 (PM)购 自浙江路桥四青生化材料厂，先被剪切成 0．5cm×1．0cm 的长条，并在 中心处压一直径为0．2cm的印痕，用以识别点样位置和限制样品扩散，备用． Eosin5-ITC(纯度≥97 ，Fluka公司)，溶于DMSO中配制成8．4mg／mL的贮备溶液，用磷酸盐 缓冲溶液(PBS，pH=7．4)稀释得到84~g／mL(1．19×10 mol／L)的工作溶液．人 IgG(~京鼎国生物 技术发展 中心)用NaHCO。一Na。CO。缓冲液(pH=9．6)稀释至 1mg／mL．羊抗人 IgG抗体 (北京鼎国生 物技术发展中心)，用PBS缓冲溶液配制成7．4mg／mL溶液．洗涤液是含体积分数为0．9 的NaC1和 0．1 的Tween2O的10mmoI／L磷酸盐缓冲溶液(pH一7．4，PBST)．免疫反应中使用的包被液是 100 mmol／L的碳酸钠缓冲溶液(pH一9．6，37℃)．封闭液是以包被液为溶剂的 10mg／mL的BSA溶液． 抗体和标记的抗体实验时均使用PBS稀释．浓度同为 1．0mol／L的无机盐溶液，除Pb(AC)。(在 2．0 mol／LHAc中)外均为水溶液，试剂均为A．R．级，水为二次亚沸蒸馏水． 1．2 实验方法 (1)固体基质室温磷光性质测量．用0．5yL平头注射器将0．4 L样品(eosin—ITC或 其标记的抗体等)悬空点样在PM 条的压痕处，室温放置 2min后在(904-1)C下干燥 1min，继而把 5yL无机盐溶液点样在该压痕处放置 20S，在(904-1)C熨斗上干燥2min后测量磷光光谱或强度． (2)抗体 的标记．移取 200yL羊抗人 IgG抗体 (抗体蛋 白浓度按A。。。 ／1．35— 1mgIgG／mL 计L6)到 1．5mL试管中，在搅拌下逐滴加入 10．0mg／mLeosin5-ITC的DMSO溶液40 L，室温下旋 涡2h．初步分离后将混合物转入cut—off管(Pallfiltroncorporation)中离心分离(转速 15000r／min，15 min)，并用PBS缓冲溶液(每次 200yL)洗涤标记产物 3次以上，直至除去游离的eosin5一ITC／．用 100yL的PBS溶液将标记抗体转出cut—off管，加入 5yL的60mmol／LNaN。溶液后，于 4C保存． (3)免疫反应及产物磷光性质测量．用0．50yL平头注射器将 0．4 L羊抗人 IgG抗体悬空点样在 收稿 日期 ：2004—03—08． 基金项 目：国家 自然科学基金 (批准号和福建省自然科学