乳糖酶基因.doc

生物技术084 张权 20080134404 基因工程在乳糖酶乳及乳制品含有丰富的优质蛋白质、脂肪、碳水化合物以及几乎全部已知的维生素和多种矿物质，还含有免疫球蛋白等抗病因子，易被人体消化吸收，是人类改善营养、增强体质的理想食品。除此之外，在牛乳等制品当中还含有5%左右的乳糖,它是牛奶中主要的碳水化合物，对人体有着重要的作用。主要表现在于乳糖能促进钙质吸收及整理肠道的功效，特别是乳糖被分解后的半乳糖是婴儿脑发育的必需物质，与婴儿大脑的迅速成长有密切关系。然而，人体却不能直接利用乳糖，它必须被乳糖酶分解为单糖的葡萄糖及半乳糖后才能被吸收和利用。据研究发现，世界各国人口都有不同程度的乳糖酶缺乏，东方人乳糖酶缺乏高达85%，从而导致“乳糖不耐症”的发生。 ??? 乳糖酶(EC3．2．1．23，又名β半乳糖苷酶)能将牛乳中的乳糖水解为葡萄糖和半乳糖，并具有半乳糖苷的转移作用［3］。利用该酶生产低乳糖制品或口服酶制剂，能够有效解决“乳糖不耐症”问题。乳糖酶广泛存在于扁桃、桃、杏、苹果和咖啡豆等植物中，大肠杆菌、乳酸杆菌、酵母菌和霉菌等微生物中，以及有效哺乳动物的小肠等器官和皮肤组织中。然而，不同来源的乳糖酶，其酶学性质相差很大。本研究从保加利亚德氏乳杆菌中成功的克隆出乳糖酶基因，并利用生物分析软件对其进行生物信息学分析。了解该酶的性质特征，为进一步研究及低成本表达该酶奠定基础。 ??? 1? 材料与方法 ??? 1.1? 材料 ??? 1.1.1? 菌株与质粒? 保加利亚德氏乳杆菌购买于广东省微生物研究所菌种保藏中心；大肠杆菌DH5α由本室保存；pGMT vector购于北京天根生化科技有限公司。 ??? 1.1.2? 试剂材料?? 细菌培养试剂购于Sigma公司；引物由上海生工合成；LA DNA聚合酶购于自大连宝生物公司；细菌基因组提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒、小量质粒提取试剂盒、DNA Ladder购于北京天根生化科技有限公司；T4连接酶、琼脂糖、荧光染料由本室保存。 ??? 1.2? 方法 ??? 1.2.1? 保加利亚德氏乳杆菌基因组DNA的提取 ??? 用灭菌双蒸水溶解干冻管里的保加利亚德氏乳杆菌，并划平板到MRS固体培养基，37 培养72 h，挑取单个菌落于MRS液体培养基进行增菌（37 摇床）。利用细菌基因组提取试剂盒提取保加利亚德氏乳杆菌基因组DNA，并用1%的琼脂糖凝胶电泳检测纯度。 ??? 1.2.2? 引物设计与合成? 从GenBank数据库中检索到保加利亚德氏乳杆菌中乳糖酶基因序列（GenBank序列号：GI149564）设计引物如下：P1：55 CGCGGATCCGCGATG AGC AA TAAGTTA3；P2：5CCGCTCGAGCGGTTATTTTAGTAAAAGGG3。上述引物由大连宝生物工程有限公司合成(下划线碱基分别为BamH I和Xho I酶切位点)。 ??? 1.2.3? 乳糖酶基因的PCR扩增与鉴定? 反应总体积为25 μL：模板DNA(1 μg/μL) 3 μL，10×buffer2.5 μL,Mg2+( 25 mM)2.0 μL, dNTP(2．5 mM)2.5 μL,引物P1(10 pmol／μL) 0.4 μL,引物P2 (10 pmol／μL)0.4 μL,LA DNA聚合酶(5 U/uL)0.2 μL,双蒸水14 μL；反应条件：98 ，1 min;94 ,30 sec;50 ℃,30 sec;72 ℃,4 min; 30个循环；72 ，5 min.然后用1％ 的琼脂糖凝胶电泳检测，同时加上500 bp Ladder对PCR产物进行初步鉴定。 1.2.4? 乳糖酶基因的克隆与鉴定? PCR扩增出目的基因，1%琼脂糖电泳，切胶后用DNA胶回收试剂盒进行纯化，得到纯化的PCR产物与pGMT vector进行连接（4 ，24 h），转入新制备［4］的感受态大肠杆菌DH5α，再涂于含氨苄青霉素的LB培养基上37 培养过夜，用接种针分别挑取仅有的4个菌落于含氨苄青霉素的LB液体培养基上增菌培养（做好标记）。采用小量质粒提取试剂盒分别对4管菌液提取质粒。采用三酶切(BamH I、Xho I和Pvu I)和PCR两种方法对重组子进行鉴定。经鉴定的阳性重组质粒由北京天根生化科技有限公司测序。 ??? 1.2.5? 乳糖酶基因序列的生物信息学分析? 利用生物软件DNAssist Version2.0对该序列进行物理化学性质的分析，推测其氨基酸序列。利用在线分析软件SOPMA对其进行二级结构分析以及在线分析软件NetNGlyc1.0进行蛋白质功能位点预测。并利用在线分析软件Blast在GenBank 数据库中进行同源性分析［5］。并利用DNAMAN软件绘制其同源关系图。 ??? 2?