乳糖酶的筛选与纯化.ppt

马洪海 M100250427 乳糖酶分布 乳糖酶(lactase)称为β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶(β-D-galactohydrolase)，简称β-半乳糖苷酶(β-galactosidase),根据不同来源可分为胞内酶或胞外酶。 乳糖酶广泛地存在于扁桃、桃、杏、苹果和咖啡豆等植物中；大肠杆菌、乳酸杆菌、酵母菌和霉菌等微生物中，以及有效哺乳动物的小肠等器官和皮肤组织中。现在商业上所有的β-半乳糖苷酶都来源于微生物发酵法，基本上由酵母和霉菌发酵获得。 乳糖酶制剂的生产 在乳制品厂附近富含乳糖的土壤中取离地面5到15cm处土样几克,盛于预先灭菌的牛皮纸袋中扎紧，采样深度0～20 厘米。 用乳糖作为唯一碳源的液体培养基增殖。 样品采 集与富集培养 ：平板划线分离或涂布，利用透明圈法，依据透明圈大小挑选菌种。 也可采用变色圈法，指示剂用溴甲酚绿。在分离培养基PH6.8中加入溴甲酚绿指示剂后呈蓝绿色，当细菌在该培养基中生长并分解乳糖产生乳酸之后使菌落呈黄色，菌落周围的培养基也变为黄色。 初筛与复筛 初筛 :复筛包括夹层法和点种法。复筛步骤以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标，从而筛选出产酶量高、性能更符合生产要求的菌种。 复筛 测定酶活 测定原理 邻硝基酚-β-D-半乳糖苷(ONPG)为易溶于水的无色化合物,β-D-半乳糖苷酶催化ONPG水解生成邻硝基苯酚(ONP),ONP在中、碱性范围呈黄色,在420nm有最大吸收峰。 注意事项 1、保持待测材料的酶活 2、在分光光度计下待测时控制反应时间 以分光光度计法为例： 以邻硝基酚-β-D-半乳糖苷(ONPG) 为反应底物，在一定反应条件下水解 10 min，生成邻硝基酚(ONP)和半乳糖，邻硝基酚在中、碱性范围呈黄色,在420nm有最大吸收峰。用分光光度计测定所生成的邻硝基酚的量，与标准曲线比较后定量。 紫外线诱变或亚硝酸诱变获得高产菌种的突变体。 利用代谢工程和代谢调节机理来提高微生物的酶产量。调整优化培养基成分，消除产物抑制等负面因素。 运用遗传工程、基因工程的手段将原有菌株中的目的基因转移到另外一些对生产环境更适应性的微生物细胞之内，使其高效表达。 微生物产酶性能的进一步提高 菌液的制备 取适量斜面菌种接种于种子培养基中, 摇床培养: 30 ℃, 180 r/min, 培养24 h。 将培养好的种子培养液按10%量接种于液态发酵培养基中。发酵条件:摇床培养28℃,180r/min,培养36h,初始pH7-7.5。 乳糖酶的浓缩与提纯步骤为：制备粗酶液、超滤、硫酸铵分级盐析、脱盐、离子交换层析、分子筛层析、第二次离子交换层析、PAGE电泳鉴定 乳糖酶的提取方法 产乳糖酶菌种的保藏 1、准备安焙管 2、准备菌种 3、制备菌悬液及分离 4、冷冻：迅速降温至-40～-70℃ 5、抽真空：完成时有干燥块 6、抽真空，封口 7、冰箱保藏 THANK YOU ！