反向遗传学在圆环病毒研究中的应用.doc

第五节 反向遗传学在圆环病毒研究中的应用 在众多的动物病毒性传染病中，圆环病毒病是一种不太引人注意的传染病，因为该病的感染过程比较长，且常与其他病原混合感染，容易混淆为其他疾病，所引起的直接经济损失也不是很高。因此，关于该类病原的基础研究相对比较少。近年来，随着人们对猪圆环病毒病关注程度的不断提高，国内、外一些学者开始重视对该类病原的研究。短短几年内，人们已在猪圆环病毒的基因组结构、基因功能、病毒致病性及毒力相关基因和基因疫苗等方面研究中都取得了显著进展。其中，反向遗传学技术发挥了重要作用，下面就对反向遗传学技术在圆环病毒研究中的应用作一简介。 一、在基因组结构与基因功能研究中的应用 Cheung[18]利用定点突变方法系统分析和研究PCV-2蛋白合成及DNA复制过程中所涉及的PCV-2的每个转录单位。结果表明，在CR的5端引入一个终止子不能影响Rep相关抗原或病毒DNA的合成，改变其他RNA的剪接位点附近的序列或者在NS0 RNA中引入终止子对病毒蛋白或DNA的复制也没有任何影响。然而，突变能产生截短的Rep或Rep蛋白，导致蛋白质的合成减少99％而且完全关闭DNA的复制，这些结果表明rep和rep是PCV-2复制所必需的基因，它们一起构成了PCV-2的功能性复制起始因子。 用PCV-1感染性克隆转染PKl5细胞12h后，对Rep、Rep两种转录本进行检测，发现其数量是类似的，但是在后期二者转录本的数量发生变化，提示这两种Rep转录本的表达存在一种动态平衡。rep基因的转录起始于(767±l0)bp处，蛋白质分子质量为36.5kDa；Rep蛋白为rep基因转录后剪辑的产物，蛋白质分子质量为19.2kDa。Rep蛋白单独不能促进PCV-1的复制，必须与Rep蛋白共同作用，才可以促进PCV-1的复制[19]。 Renshaw等[20]利用CIAV的感染性克隆等对CIAV VPl进行了分析研究，结果发现了一段氨基酸高变区，其位置在VPl的第139～151位氨基酸之间。在此基础上，他通过构建Cux-1(C)和CIA-1的嵌合体研究了该高变区对细胞致病性的影响，其结果显示，改变VPl的第139～144位氨基酸之间的任何1或2个氨基酸都将影响病毒复制和侵染的速度。他进一步证明VPl的高变区及其上游的氨基酸发生变异会导致CIA-1在MSBl(L)细胞亚系中丧失复制能力。 Cheung[21]在建立PCV感染性克隆的基础上，对PCV-2基因组复制起始点的保守九核苷酸基序进行突变研究，发现在PCV-2复制起点的八核苷酸基序(AGTATTAC)是病毒蛋白质合成、DNA复制及子代病毒稳定产生的必需核心元件(ECE)，该八核苷酸序列可以进一步被浓缩为一个必需的核心片段：AXTAXTAC(X代表不同的碱基)。 二、在病毒致病性研究中的应用 通过构建嵌合病毒对VP1基因的研究表明(图18-4)，其中，存在一个二级调控因子区，这一区域的某个氨基酸的变化，可导致VP2蛋白和VP3核定位信号区域的氨基酸序列发生改变。Scott等[22]通过研究认为，VPl编码区6个氨基酸的变异导致了在MDCC-SSBl细胞上传代310次的Cux-1株与针对VPl的单抗(MAb29和4H4)的结合能力减弱和致病性的降低，并认为VPl89位氨基酸是决定病毒与MAb29结合能力强弱的关键位点。 将PCV-2在PKl5细胞系上连续传代培养，发现病毒的致病性和增殖能力均发生改变，通过对不同代次PCV-2的基因序列比对分析，发现PCV-2的基因组有两个碱基发生规律性变异，Fenaux等[23]推测这两个碱基突变可能是导致病毒生物学特性发生变化的遗传因素。后来，他利用反向遗传学技术证明了该推论，他认为病毒衣壳蛋白的第110位氨基酸突变(P→A)和第191位氨基酸突变(R→S)不仅可以提高圆环病毒在宿主细胞中的增殖能力，而且能减弱病毒对宿主的致病力。 图18-4构建嵌合PCVl-2感染性克隆的技术路线示意图[25] 三、在新型疫苗研究中的应用 近年来，由猪圆环病毒感染造成的断奶仔猪综合征及其他相关疾病受到人们的高度重视。因为该病毒病不仅能给生猪生产造成较大经济损失，而且能干扰猪的免疫系统，造成免疫抑制并导致其他疫苗的免疫失败，造成继发感染或其他疫情的发生。因此，研制圆环病毒病疫苗已成为科研工作者的重要任务之一。实践证明，利用常规手段研制该病疫苗是很困难的。因为，PCV-2在体外培养的病毒滴度偏低，所做的疫苗不能为动物提供足够的保护。 猪圆环病毒感染性克隆的成功构建，为研制该病的疫苗带来了希望。人们可以在了解PCV基因组结构与功能的基础上，利用反向疫苗学方法研制新型的圆环病毒病疫苗。例如，可以在PCV-2基因组中插入合适的酶切位点，拯救出带有该标记的重组病毒，研制能与野毒感染区分的标记疫