烟草淀粉酶活性与多酚氧化酶活性测定实验方案.doc

烟草中淀粉酶活性与多酚氧化酶活性的测定 淀粉酶活性的测定 原理：根据淀粉酶水解淀粉产生的一系列还原性糖类可将3，5-二硝基水杨酸还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，通过溶液颜色的深浅可反映出还原性糖类的浓度，也就可以间接反映出淀粉酶的活性，因此，可以用比色法，通过标准曲线测定淀粉酶的活性。 实验材料，仪器，试剂 （1）.材料：烟草新鲜叶片组织 （2）.仪器：a.分光光度计 b.离心机 c.恒温水浴锅 d.具塞刻度管 e.容量瓶 （3）.试剂：a.标准麦芽糖溶液（1mg/ml）；精确称取100mg麦芽糖，用蒸馏水溶解，定容至100ml。 b.3，5-二硝基水杨酸（10mg/ml）；精确称取1g3，5-二硝基水杨酸，溶于20ml12mol/L的HONa溶液中，加入50ml蒸馏水，再加30g酒石酸钾钠，待其溶解后用蒸馏水定容至100ml。 c.1﹪氯化钠溶液，称取5g氯化钠于500ml容量瓶中定容。 d．1﹪淀粉溶液；称取1g淀粉溶于100ml0.1ml/L的柠檬酸钠溶液中。 实验步骤 （1）.仪器药品的准备与配置；按实验需求，将所有实验中用到的器材（大型实验设备应进行检查，做好使用前准备工作）试剂准备好 a.器材包括称量用到的分析天平以及电子天平，溶解用到的容量瓶（100ml×；1000ml×2），烧杯(包括100ml×5和500ml×1)，玻璃棒，量筒等，以及实验用的数支具塞刻度试管，将上述仪器洗净并用蒸馏水浣洗，同时检查分光光度计，离心机，恒温水浴锅等设备 b．按照要求将所需求的试剂按步骤配制好，贴好标签，待用 c．冷冻样品提前做好解冻工作 （2）．标准曲线的制作；取10支具塞刻度试管，分别编号，以1号为空白对照分别按下表加入相应试剂 编号 试剂 1 2 3 4 5 6 7 8 9 标准麦芽糖溶液（ml） 0 2 4 6 8 10 12 14 16 3,5-二硝基水杨酸溶液（ml） 2 2 2 2 2 2 2 2 2 定容至20m1 l00℃水浴锅反应5min 之后取出用流水冷却，以1号试管为空白调零点，在540nm波长下比色测定2～10号试管的OD540值，以麦芽糖含量（浓度）为横坐标，各浓度下的OD值为纵坐标，用坐标纸绘制标准曲线，求出回归方程。 （3）．酶溶液的提取；将样品分别编号，按以下步骤分别操作 a．称取2g样品于研钵中，加入少许石英砂和2ml氯化钠溶液，研磨成匀浆； b.将匀浆转入离心管中，并用6ml氯化钠溶液分次洗涤研钵，将残渣一并洗入离心管内，于室温下放置15～20min，没隔数分钟搅动一次，使其充分提取 c．然后待全部样品按上述步骤完成后，一次性转入离心机内，以3000r/min的转速离心10min，将上清液到入100ml容量瓶中，定容，摇匀，贴上相对应于样品的编号，即为淀粉酶原液，依据实际情况做好保存工作，防止酶活性退化或酶失活 （4）．样品淀粉酶活力的测定；对于每个样品进行一下操作 取两支具塞刻度试管，编号为1和2，按下表加入以下试剂 试管编号 试剂 1 2 样品酶原液（ml） 2 0 100℃水浴锅中煮10min 样品酶原液（ml） 0 2 1﹪淀粉溶液（ml） 2 2 37℃水浴锅中反应10min 3，5-二硝基水杨酸溶液（ml） 2 2 100℃水浴锅反应5min 用蒸馏水定容至20ml，适当稀释后于540nm波长下测定OD值，以1号试管为空白调零 分别对每个样品按上述（4）步骤进行检测，记录相关数据并计算结果，将数据汇总后做成表格， 其中样品淀粉酶活力=C×VT/(W×Vs×T)(mg/g/min)。式中，C为从标准曲线上查得的麦芽糖含量（mg）；VT为淀粉酶原液总体积（ml）；Vs为反应所用淀粉酶原液体积（ml）；W为样品重量（g）；t为反应时间（min）。 OD值 A=520.00 nm 还原糖含量 (mg/ml) 酶活力(mg/g/min) WB-08 0.142 0.742 2.373 WB-11 0.170 0.919 2.941 WB-15 0.146 0.767 2.454 WB-19 0.243 1.381 4.420 WB-12 0.144 0.754 2.414 WB-18 0.214 1.198 3.832 WB-09 0.119 0.596 1.907 WB-13(1) 0.280 1.616 5.170 WB-16 0.155 0.824 2.637 WB-17 0.147 0.773 2.474 WB-13(2) 0.202 1.122 3.589 WB-20 0.257 1.470 4.704