第二章 工具酶(ye).ppt

1.7 同裂酶（Isoschizomers) 1.7.2 不完全同裂酶 1.8 同尾酶(Isocaudamers） 3.3 T4-DNA聚合酶 3.3.1 T4-DNA酶的基本特性： 在无dNTP时，可以从任何3‘-OH端外切 在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止 在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位 5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切酶活性 3.3.2 T4-DNA聚合酶的基本用途： 切平由核酸内切酶产生的3’粘性末端 5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-P HO-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ T4-DNA聚合酶 5‘ … G-C-T-C- OH P-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-P HO -C-C-T-C … 5’ 注意：该酶也能降解双链DNA，只是其活性比单链降解活性低很多 T4-DNA聚合酶的基本用途： DNA片段的同位素末端标记 5‘ G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3’ 3‘ C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5‘ Mg2+ 5‘ ppp dN 5‘ ppp dA（a-32P-dATP） 5‘ G-C-T-C A-G-C-T-G-OH HO-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5‘ T4-DNA pol T4-DNA pol 5‘ G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3’ 3‘ C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5‘ 3.4 耐热的DNA聚合酶（Taq酶等） 3.4.1 Taq DNA 聚合酶 水生栖热菌(Thermus aquaticus)YT1株分离提取。 具有5‘-3’外切酶活性，但不具有3‘-5’外切酶活性，因而在合成中对某些单核苷酸错配没有校正功能。 最适温度：75-80℃　　 TaqDNA聚合酶还要具有非模板依赖性活性，可将PCR双链产物的每一条链3加入单核苷酸尾，故可使PCR产物具有3突出的单A核苷酸尾；应用这一特性，可实现PCR产物的T-A克隆法。 3.4.2 高保真DNA聚合酶(pfu DNA 聚合酶) Pyrococcus furiosis中精制而成. 不具有5‘-3’外切酶活性，但具有3‘-5’外切酶活性，可校正PCR扩增过程中产生的错误，使产物的碱基错配率极低。 PCR产物为平端，无3端突出的单A核苷酸。 3.5 依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶） 3.5.1 反转录酶的基本特性：以RNA为模板聚合cDNA链 3’AAAAAAAAAAAAAA 5’mRNA 反转录酶 Mg2+ dNTP 5’TTTTTTTTTTTT oligo (dT) 12-18 3’AAAAAAAAAAAAAA 5’mRNA 5’TTTTTTTTTTTTTT 3’cDNA 反转录酶的基本特性：双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链 反转录酶 3’ RNA 5’ DNA 3’ 5’ 3’ RNA 5’ DNA 3’ 5’ 反转录酶 5’ DNA 3’ 4 核酸酶 4.1 单链核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII） 大肠杆菌的核酸外切酶VII不需要Mg2+ ExoVII 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 4.2 双链核酸外切酶：核酸外切酶 III（ExoIII） ExoVII 3’ 5’ 3’ 5’ Mg2+ 3’ 5’ 3’ 5’ 大肠杆菌的核酸外切酶 III 特异性地从3‘ 端外切 4.3 双链核酸外切酶：l 核酸外切酶（ lExo） lExo 3’ 5’ 3’ 5’ Mg2+ l核酸外切酶特异性地从5‘ 端外切 3’ 5’ 3’ 5’ 4.4 单链核酸内切酶：S1核酸酶 4.4.1 S1核酸酶的基本特性： Zn2+必需 最适pH范围为4.0 - 4.3 需要NaCl 10 - 300 mM 降解单链DNA的速度比降解双链DNA快75000倍 降解单链DNA的速度比降解单链RNA快7倍 来自稻谷曲霉菌（Aspergillus oryzae） 4.4.2 S1核酸酶的基本反应：内切单链DNA或RNA 5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-C-T-T-G-A-G-G-A-G-T… 3’ S1 Zn2+ 5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-C T-T-G-A-G-G-A-G-T… 3’ 5‘ … G-C-T-C A-G