第二十一章 基因诊断治疗.pptVIP

第十二章  基因诊断与基因治疗Gene diagnosis gene therapy 第一节 基因诊断 一、概念和特点 概念：利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法，直接探测基因结构及其表达水平，从而对疾病作出诊断的方法。 检测目的物分为DNA和RNA两类。 特点：病因诊断、特异性高、灵敏度高、针对性强、适用性强 二、常用技术方法 核酸分子杂交 聚合酶链反应（PCR） 限制酶切分析 单链构象多态性分析 基因测序 基因芯片(chip) （一）核酸分子杂交： 检测样本中是否存在与探针序列互补的核酸分子，并可作某种定量分析。 Southern blot：基因组和基因分析（特异性片段定性和定量） Northern blot：RNA（尤其mRNA）的定性和定量分析 Dot blot：特定基因定性和定量分析，特点是简单、快速 原位杂交：在组织、细胞和染色体水平作核酸定性和定量分析，并可定位 （二）聚合酶链反应（PCR） 原理：体内半保留复制的体外进行 反应体系组成：模板DNA、特异引物、DNA聚合酶、dNTP以及含Mg2+缓冲液。 基本步骤：变性（95oC）、退火（低Tm 5oC)、延伸（70oC）三步的反复循环过程 特点：简便、快速、特异、灵敏和样品要求低等特点，应用十分广泛。 类型：逆转录PCR、多重PCR、定量PCR和原位PCR等 DNA和RNA的微量分析 基因突变分析： 常与其他方法合用如： PCR/ASO, PCR/SSCP,PCR/RFLP等 目的基因克隆 逆转录反应结合，获得mRNA的基因片段 利用特异性引物从文库中获得目的基因片段 基因的体外突变 测序 三、基因诊断的应用 感染性疾病 病毒性疾病的诊断：HBV、HCV、HIV和HPV 细菌性疾病的诊断：TB、疟原虫 遗传性疾病 镰刀状细胞贫血症：beta-珠蛋白基因AT变换 甲型血友病：凝血因子VIII 肿瘤：机制、分类、分型和预后等 癌基因突变：ras、c-myc 抑癌基因突变：p53、p16、p105 产前诊断、移植配型 法医鉴定 DNA指纹（fingerprint） 针对VNTR的酶切和southern blot ，PCR-STR， 第二节 基因治疗 一、概念及策略 （一）概念： 经典的基因治疗：指正常的基因整合入细胞基因组以校正或置换致病基因的一种治疗方法。 广义的基因治疗：将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病目的的方法。 （二）策略： 基因矫正 基因置换 基因增补 基因失活：反义核酸、核酶、三连技术、RNA干扰 免疫基因疗法：DNA疫苗，免疫因子基因导入 活化前体药物基因疗法 （“自杀基因” ）：如单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK），催化核苷酸类似物生成有毒中间物，阻断DNA合成 化疗保护性基因疗法：多药抗性基因（MDR-1）导入骨髓干细胞 二、基因治疗的基本程序 基因治疗方法： 间接体内治疗法（ex vivo） 直接体内治疗法（in vivo） 基本程序： 治疗性基因的选择 基因载体的选择 靶细胞的选择 基因转移 外源基因表达的筛选 回输体内 基因转移 基因导入受体 细胞的方法 基因转染细胞筛选与鉴定 利用标记基因筛选： 抗药性基因（neor）的选择性培养、 进一步检测基因存在和基因序列测定 目的基因表达鉴定： mRNA和蛋白质检测 （六）回输体内 三、基因治疗的应用与展望 (一)基因治疗应满足的条件： 1、单基因缺陷疾病 2、仅限体细胞的基因治疗 3、靶细胞易获取、培养、及回输体内。 4、治疗效果应胜过对病人的危害。 5、表达水平无需调控且无副作用。 6、需经动物实验验证安全可行。 （二）基因治疗有待解决的问题 1、难以