5 葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质.pptVIP

葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质 教学目标 了解：层析技术的基本原理; 有效分配系数Kav的计算。 理解：葡聚糖凝胶的选择和准备。 掌握：凝胶层析的原理和操作方法; 有效分配系数Kav的意义。 重点： 凝胶层析的原理和实验步骤。 分配系数与被分离分子量之间的关系。 难点： 掌握装柱,加样,洗脱,收集样品的操作步骤。 蛋白质的分离纯化 蛋白质分离纯化的方法很多，主要是根据蛋白分子之间特异性的差异，如分子大小，溶解度，电荷等建立起来的。 凝胶层析（又叫分子筛层析或排阻层析）指混合物随流动相经过装有凝胶作为固定相的层析柱时，各组分因分子大小不同而被分离的技术。 凝胶：一些具有立体网状结构 和一定孔径的高分子化合物。 凝胶层析过程的数理关系 洗脱体积（Ve）：自加入样品时算起，到组分最大浓度出现时所流出的洗脱液体积。 凝胶层析的分配系数 分配系数Kav：表示任何一种被分离的化合物被凝胶排阻的程度。 Kav与凝胶柱的总体积Vt、外水体积Vo、洗脱体积Ve有关： Vt和Vo恒定，Ve随分离物分子量的变化而变化 葡聚糖凝胶柱层析法的特点 天然凝胶：一些糖类物质，如淀粉、琼脂及琼脂糖等。 人工合成凝胶：葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两大类。 葡聚糖凝胶（Sephadex）：由许多右旋葡萄糖单位通过 1，6-糖苷键联结成链状结构，再由交联剂交联形成不溶 水的多孔网状高分子化合物。 型号：G200、 G150、 G100、 G75、 G50、 G25、 G15 本实验中用Sephadex G 50（分离分子量范围1500~20000），以蒸馏水为洗脱剂。 待分离的蛋白质混合物： 蛋白A（黄色，分子量在G 50的分离范围内）蛋白B（蓝色，分子量大于G 50的分离范围） 实验步骤 凝胶的准备 2. 装柱（2～3人一组） 层析柱洗净后，将层析柱烧结板下端的死区用蒸馏水充满（注意：不得留有气泡，可多加约1cm高水层，使柱内凝胶通过沉积作用更加均匀），然后关闭层析柱的出口。 将已溶胀的凝胶悬液沿玻璃棒小心地徐徐灌入柱中，待底部凝胶沉积1～2cm时，再打开出口，继续加入凝胶悬液至凝胶沉积约10cm高即可（注意：凝胶悬液尽量一次加完，以免出现不均匀或分层的凝胶带）。 反复加蒸馏水，平衡10min。 3. 加样与洗脱 加样时先将柱的出口打开，让蒸馏水逐渐流出，待凝胶床面只留下极薄的一层蒸馏水时，关闭出口（注意：不可使凝胶柱表面干涸，可预留约0.2cm高水层）。 用移液枪将200μl样品小心加到凝胶柱表面（注意：加样时垂直伸入柱内，接近液面处集中滴加，动作要轻柔）。 然后打开出口，使样品进入床面，滴加1~2倍样品体积的蒸馏水（注意：轻柔滴加）。 待样品完全流入床内后，再加蒸馏水进行扩展洗脱。 4. 样品收集：样品一旦加入后马上用烧杯收集流出液，注意柱床上要不断加水，直到两种蛋白全部洗脱。倒出凝胶，清洗层析管。 5. 结果分析：分析为什么这两种蛋白能在凝胶柱中分离开。 注意事项 装柱时需保持柱体垂直于水平面，在平衡完毕前不可随意晃动层析柱，以保持凝胶柱表面平整。 实验过程中需密切注意保持层析柱中的凝胶始终处于蒸馏水中，防止蒸馏水排空。 移液器使用： 选择适当量程 正确安装枪头 吸液第一档，放液第二档 垂直吸液，慢吸慢放 吸液后不可将枪平放 使用完后调至最大量程 小 结 凝胶层析的原理：混合物随流动相经过装有凝胶作为固定相的层析柱时，各组分因分子大小不同而被分离。 凝胶层析分配系数：被分离的化合物被凝胶排阻的程度。Kav = （Ve — Vo）/（Vt — Vo） 葡聚糖凝胶柱层析：葡聚糖凝胶为多孔网状高分子化合物及交联度G的意义。 掌握装柱、加样、洗脱、收集样品的操作。 实验结果 思考题 为什么分离物分子量越大Kav值越小？ 用凝胶柱层析分离不同蛋白质，怎样才能得到较好的分离效果？ * * 方法 性质 亲和层析 对配体分子的亲和力 吸附层析 吸附性质 电泳、离子交换层析等 电荷 等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀等 溶解度 透析、超滤、密度梯度离心、凝胶层析等 分子大小 凝胶层析的基本原理 分子大于凝胶孔隙范围的物质： 随着溶剂在凝胶颗粒间流动 分子小于凝胶孔隙范围的物质： 渗