8DEAE-纤维素离子交换层析纯化血清白蛋白.pptVIP

综合实验（一）　血清蛋白质的纯化与鉴定 蛋白质的分离纯化 蛋白质的分离纯化是对蛋白质进行研究的一项必需的和基础的工作。目前常使用的分离纯化的方法或技术都是在了解蛋白质性质和结构特点的基础上建立的。 目标蛋白质的分离纯化程序主要包括 ⑴材料的选择； ⑵组织匀浆和破碎细胞获取粗提取液； ⑶蛋白质初步提纯； ⑷选择一种或几种合适的方法除去杂蛋白,直至完全纯化； ⑸目标蛋白的鉴定。 用于研究目的蛋白质通常应保持它的生物活性 较低温度下(0－4℃)操作，注意使用蛋白酶(使蛋白质降解的酶)的抑制剂，避免使用剧烈条件，以免蛋白质特定的折叠结构受到破坏。 实验目的 分离血清得到高纯度的白蛋白 对纯化得到的白蛋白进行电泳鉴定 实验内容 第一部分： （本周） 采用DEAE-纤维素离子交换层析纯化血清白蛋白 第二部分： （下周） 采用醋酸纤维素薄膜电泳鉴定纯化得到的白蛋白 第一部分 DEAE-纤维素离子交换层析（Ion Exchange Chromatography, IEC）纯化血清白蛋白 本次实验目的 1、分离血清得到高纯度的白蛋白 2、掌握DEAE-纤维素离子交换层析原理与实验操作技术 3、了解紫外检测仪、自动部分收集器、记录仪、恒压高位槽的原理与使用方法 离子交换层析（Ion Exchange Chromatography, IEC）的基本原理 根据待分离物质带电性质不同的分离纯化方法。 以离子交换剂为固定相，特定的离子溶液为流动相，依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同进行分离纯化的层析方式。 离子交换剂 离子交换剂的选择 考虑因素： 1.被分离物质带何种电荷 2.被分离物质分子的大小 大分子物质选用凝胶，其次选用纤维素 3.被分离物质所处的环境 4.被分离物质的物理化学性质 5.被分离物质的大概数量 起始缓冲液的选择 原则： 不能与样品发生化学反应，避免使样品变性。 其pH值和离子强度等能使样品中有效成分与离子交换剂结合，而不能使样品中杂质与离子交换剂结合。 洗脱液 指一定离子强度与一定pH值的缓冲溶液 洗脱方法： 改变洗脱液的离子强度 ?增强洗脱液与离子交换剂的结合力 改变洗脱液的pH ?降低待分离物与离子交换剂的结合力 洗脱方式： 阶段洗脱法 梯度洗脱法 人血浆蛋白质的等电点及分子量 实验原理 采用DEAE-纤维素离子交换层析纯化血清白蛋白。 血清样品用0.06mol/L醋酸铵缓冲液（pH 6.5）稀释5倍后上柱。在此pH与离子强度时，DEAE-纤维素带有正电荷，能吸附带负电荷的蛋白质如白蛋白（pI 4.9）。 带正电荷蛋白质如γ-球蛋白（pI约7.3），不被吸附故直接流出。用0.06mol/L醋酸铵缓冲液洗脱吸附在离子交换柱上的少量β-球蛋白及α-球蛋白。 将醋酸铵浓度提高至0.3mol/L，白蛋白被洗脱下来（尚混有少量α-球蛋白）。 整个层析过程用紫外检测仪监测流出蛋白组分，用自动部分收集器收集，用记录仪记录整个洗脱过程。 材料与试剂 1、主要材料 pH计、层析柱（1.6×20cm）、固定架、聚乙烯管（不同规格）、HD-3紫外检测仪、自动部分收集器、记录仪、恒压高位槽等。 2、主要试剂 0.06mol/L NH4Ac缓冲液（pH 6.5） 0.3mol/L NH4Ac缓冲液（pH 6.5） 1.5mol/L NaCl—0.3mol/L NH4Ac缓冲液（pH 6.5） 3、样品：血清 实验步骤 DEAE—纤维素层析柱的准备 （1）酸碱处理：DEAE-纤维素可按0.5mol/L NaOH → 0.5mol/L HCl →0.5mol/L NaOH（碱→酸→碱）程序处理。 （2）装柱：选用短而粗的层析柱（1.6cm×20cm。将经上述酸碱处理的纤维素用0.06mol/LNH4Ac缓冲液（pH 6.5）浸泡后装柱，柱床体积约1.6cm×6cm。 装柱时应注意装柱均匀，柱床内不得有界面、气泡，表面要平整。 （3）平衡：装柱后接上恒压贮液瓶，用0.06mol/L NH4Ac （pH 6.5）洗涤平衡，流速 1ml/min。 2、DEAE—纤维素层析纯化白蛋白 1）上样：将4ml 用缓冲液稀释后的血清样品加入上述已平衡好的层析柱表面，使样品进入柱床内。小心用4ml 0.06mol/L NH4Ac缓冲液洗涤沾在管壁上的蛋白质样品，使其进入床内。 2）穿流峰的洗脱：连接层析系统，继续用0.06mol/LNH4Ac缓冲液（pH6.5）洗脱未吸附到层析柱上的蛋白，直到记录仪基线基本恢复到原始位置。然后将柱中的缓冲液面降至与柱床表面平齐。 3）白蛋白的纯化：改用0.3mol/LNH4Ac缓冲液（pH6.5）洗脱。每管1ml分部收集 (调