12-病毒感染的实验室诊断.ppt

病毒感染的实验室诊断 病毒感染的实验室诊断: 指从病人、带毒者、外环境中采集标本经过适当的处理，采用一系列物理、化学、生物学等手段，将病毒从标本中分离出来，并通过有关特异性方法鉴定病毒的全过程。  第一节 标本的采集和处理 一、标本的采集 根据发病规律和病程取相应的标本。 采集部位： 从病原体入侵部位取材：流感病毒取咽喉拭子 从病原体感染的靶器官取材：HIV患者取血 从病原体排泄途径采集；HAV、HEV及轮状病毒 从环境取材：空气、水、土壤、生物材料等 采集时间： 早期采集/早期-晚期采集。 二、标本的运送与储存 标本采集后尽快送检 不能及时检验，应注意保存 耐低温的病毒标本温度越低越好 血液标本等4℃保存 采集标本时注意防护，避免被感染 做好标记 组织块：置50%中性甘油盐水中送检。 三、标本的处理目的：提高病毒分离率，防止标本污染。 鼻咽等拭子标本的处理 加1000U/ml的青霉素和链霉素处理后再离心 血液标本的处理 需抗凝血，离心后取血浆 粪便标本 加10000U/ml的青霉素和链霉素处理，过夜后加适量Hanks液和少量石英沙，使病毒充分释放，离心后取上清 尿液标本的处理 加1000U/ml的青霉素和链霉素处理， 4℃作用4h 脑脊液标本的处理 组织标本的处理 先剪成碎块后再匀浆，再按粪便标本方法处理 生物标本的处理 类似组织标本 水体标本 病毒为严格活细胞内寄生物，在无生命环境中不能生长，常用于病毒分离培养的方法包括：细胞培养、鸡胚接种、动物培养。 一、细胞培养技术 细胞培养技术 定义 对组织分散的单个细胞或某型细胞群进行的体外培养方法 即模拟体内的生理条件，提供细胞适宜的营养条件和温度在无菌操作的基础上，使离体组织细胞生长繁殖并进行传代的技术 组织培养 器官培养 组织培养 细胞培养 细胞培养的优点 为病毒提供了生理特性基本一致的环境 可消除动物试验中特异性抗体或非特异性抑制因子的影响 易进行无菌操作 易显示病毒增殖的特征如CPE 可通过多种方法判断病毒类型：病毒核酸类型，血凝试验、免疫荧光和酶 可定性和定量监测病毒量;空斑试验和50％组织培养感染剂量（TCID50) 结合分子生物学技术可进行病毒快速检测 1、原代细胞培养（primary cell culture） 来源人或动物的胚胎组织或正常组织 常用的原代细胞主要有：人胚肺、人胚肾、人胚肝、鸡胚、地鼠肾、地鼠肝、猴肾等 特点：对病毒敏感性最高，但制备烦琐，保存不易，一般只能传几代 2、二倍体细胞培养（diploid cell culture） 染色体仍保持二倍体特性，染色体总数为46条，属于正常细胞 缺点：一般只传50代，随着代数的增加，敏感性降低 非常安全，常用于分离鉴定病毒和疫苗生产 常见的有：WI-38、WI-26 3、传代细胞培养（continuous cell） 由原代细胞连续传代或由肿瘤细胞培养而来 常见的有：BHK21（传代地鼠肾）、HeLa（宫颈癌）、Vero（传代非洲绿猴肾）、A549（人肺癌） 易于保存、使用方便 细胞培养技术 （一）细胞培养的设施和条件 常用设备与器材 实验设施与设备：万级无菌室，超级工作台、倒置显微镜、CO2孵箱、离心机、低温冰箱、液氮罐及高压蒸汽灭菌器、干烤箱、滤菌器 实验器材：培养瓶、培养板 实验器材的处理 玻璃器皿：浸泡 包扎与灭菌：处理完后再烘干 滤过除菌：细胞培养液、血清等，常用滤膜孔径0.45μm 常用试剂和培养液 （二）无菌操作技术和细胞检查技术 无菌操作技术 紫外灯照射，注意75％酒精消毒台面 所有过程均要无菌操作 细胞检查技术 活细胞形态观察：倒置显微镜 细胞计数：血球计数板 细胞常用台盼兰染色：活细胞拒染，死细胞为蓝色，活细胞比例超过95％ （三）细胞冻存、复苏及运输 细胞的冻存 加冻存液甘油和二甲基亚砜(DMSO)，防止冰晶形成 在－20℃～0 ℃缓慢冰冻，最后－70 ℃保存 细胞的复苏 在室温下快速融化 细胞运输 优点： 为一活的机体，有神经血管的分布及脏器的构造 组织分化程度较低，可多种途径接种，病毒易繁殖，在病毒感染的膜和液体中含有大量的病毒 鸡胚来源充足，很少携带病毒和细菌，对多种病毒敏感，不产生抗体 缺点： 不产生特异性指征 可被食入的抗生素抑制感染物 可携带细菌（沙门氏菌）和病毒（Rous肉瘤病毒） 尿囊腔接种 流感病毒、流行性腮腺炎病毒、新城鸡瘟病毒的传代 取9－11日龄的鸡胚 检卵灯下划出气室和胚胎位置 收集尿囊液前4 ℃冰箱过夜 羊膜腔接种 分离流感病毒；收集羊水和尿囊液 收集前4 ℃冰箱过夜，目的是冻死鸡胚，使血液凝固，避免病毒凝集红细胞造成滴度的下降 绒毛尿囊腔接种 牛痘病毒、天花病毒、单纯疱疹病毒的分离，可在膜上出现斑点状或痘疱状