什么是RNA干扰.doc

什么是RNA干预或RNA干扰（RNA interference，RNAi）？ 一、定义 RNA干预或RNA干扰（RNA interference，RNAi）作为一种生物学现象，它是由双链RNA（dsRNA）介导的由特定酶参与的特异性基因沉默现象，它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。可以对内源mRNA，也可以对外源mRNA为降解目标，这种基因沉默现象是一种核苷酸序列特异性的自我防御机制。当外源基因导入或病毒入侵后，细胞中与转基因或入侵病毒RNA同源的基因发生共同基因沉默的现象。 二、发现 1995年，康奈尔大学的Su Guo博士用反义RNA阻断线虫基因表达的试验中发现，反义和正义RNA都阻断了基因的表达。1998年，Andrew Fire的研究证明正起作用的是双链RNA。这些双链RNA是体外转录正义RNA时生成的。这种双链RNA对基因表达的阻断作用被称为RNA干预或干扰。随后的研究中发现，RNAi现象广泛存在于真核生物体内，可用来抵御病毒的感染，阻断转座子的作用。RNAi目前作为一种应用广泛的生物研究技术和生物工程技术，具有多方面的用途。 三、作用机理 细胞利用Dicer酶（参与RNAi反应的Dicer酶为RNA酶Ⅲ家族的一个成员，它能切割双链RNA，Dicer酶包括一个螺旋酶结构域，两个RNA酶Ⅲ结构域，一个双链RNA结合位点。）将双链RNA切割裂解成21到23个核苷酸的片断，称为短干预或短干扰RNA（short interference RNA，siRNA）或微RNA（microRNA）。外源dsRNA或内源pre-miRNA可被Dicer酶加工并掺入到RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC），使mRNA分子引发翻译阻遏（translational repression）。外源dsRNA或内源pre-miRNA掺入到RNA诱导的转录沉默复合体（RNA-induced transcriptional silencing complex，RITS）中会诱导基因组保持活性如组蛋白甲基化（histone methylation）和染色质重组织（chromatin reorganization）。 研究发现，少量的双链RNA就能阻断基因的表达，并且这种效应可以传递到子代细胞中。细胞内这种RNAi效应的扩增系统是由于真核细胞中存在能以RNA为模板指导RNA合成的聚合酶（RNA-directed RNA polymerase，RdRP），RdRP可使细胞内的双链RNA通过类似于PCR的反应过程，呈指数级的数量扩增。因此，当双链RNA进入细胞后，一方面在Dicer酶的作用下被裂解成siRNA，另一方面在RdRP的作用下自身扩增后，再被Dicer酶裂解成siRNA。SiRNA的双链解开变成单链，并和某些蛋白形成复合物，Argonaute为RISC复合物中的催化组分（有人形象地称为“切片机”）。此复合物同与siRNA互补的mRNA结合，一方面使mRNA被RNA酶裂解，另一方面以SiRNA作为引物，以mRNA为模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互补链。结果mRNA也变成了双链RNA，它在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。这些新生成的siRNA也具有诱发RNAi的作用，通过这个聚合酶链式反应，细胞内的siRNA大大增加，显著增加了对基因表达的抑制。从21到23个核苷酸的siRNA到几百个核苷酸的双链RNA都能诱发RNAi，但长的双链RNA阻断基因表达的效果明显强于短的双链RNA。 四、应用 RNAi作为一种功能强大的生物技术，可通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA（有义RNA 和反义RNA），反义RNA与正链RNA形成双链RNA，导内源靶基因的mRNA降解，特异性地抑制靶基因和阻止基因表达，使相应的功能表型缺失（属于转录后水平的基因沉默（post - transcriptional gene silence，PTGS））或达到基因敲除的效果。 利用RNAi进行基因敲除的第一步是双链RNA的构建。双链RNA可先在体外构建好，然后转染细胞。在体外构建双链RNA时，分别在体外转录出正义和反义RNA，再将两者退火，形成双链RNA。体外合成的双链RNA可以用脂质体转入细胞中。但有些细胞脂质体转移效果差，转移到细胞内的双链RNA半衰期短。而先在体外构建能表达双链RNA的载体，再将载体转移到细胞内在细胞内合成出双链RNA，不但能增加有效转染细胞的种类，而且在长期稳定表达载体的细胞株中，双链RNA能够长期发挥阻断基因的作用。在构建双链RNA的表达载体时，使用RNA多聚酶Ⅲ来指导RNA的合成。 目前RNAi在大规模高通量的研究基因的功能、研究信号传导通路、病毒感染，肿瘤等