单克隆抗体制备典型实例.ppt

单克隆抗体制备实例 “研究对象” 没有硬件，没有软件 有硬件，没软件 硬件软件均有，进行过单抗制备，但未筛选到抗体或未筛选到合适的抗体 试剂盒开发外包：抗体配对，抗体竞争 LPS脂多糖单克隆抗体制备 客户需求：IgG型抗体 问题所在：LPS为脂类蛋白，有佐剂的功能，每次免疫均为初次免疫，常规免疫方案无法得到有效的IgG表达 方案解决： 1.通过查阅相关文献，LPS属于超级抗原，本身具有免疫应答作用，同时该蛋白释放IgG时间较其他蛋白稍晚！ 2.免疫方案：常规免疫2次，使机体产生抗血清；随后在加强免疫后的第3、5、7、10天进行连续加强免疫；在加强免疫后的第3、5、7、10、14天采血检测IgG特异抗血清的效价 27k 27k 81k 240k 81k 1.结果显示，加强免疫后的第10天开始血清效价在下降！ 2.融合时间的选择：常规融合在最终免疫后的3—5天；本项目融合选在最终免疫后的第7天进行融合 3.结果：筛选得到的阳性细胞株均为IgG型 Cry1系列单克隆抗体制备 客户需求：筛选出特异抗Ac的单克隆抗体 问题所在：Ac与对筛蛋白Ab之间交叉严重，常规筛选方法无法准确的筛选出特异Ac抗体且操作繁琐 方案解决：应用免疫磁珠方法分别将Ac和Ab偶联在免疫免疫磁珠上，再用该偶联免疫磁珠筛选细胞，排除Ab抗性的细胞，选择Ac抗性的细胞 1:1000 1:3000 1:9000 1:27000 1:81000 1:246000 1:738000 PBS Ab包被 0.123 0.103 0.055 0.061 0.058 0.079 0.043 0.051 Ac包被 3.501 3.501 2.938 1.879 0.802 0.351 0.12 0.032 C包被 0.729 0.334 0.128 0.081 0.058 0.046 0.048 0.047 先将融合细胞过Ab蛋白-磁珠，排除分泌Ab蛋白的融合细胞；再将非Ab分泌细胞过Ac单笔-磁珠筛选出Ac分泌融合细胞进行培养 经过筛选获得4株分泌Ac单克隆抗体 “采摘” 蛋白信息——免疫原：来源，大小，缓冲体系，保存条件，稳定性(是否容易降解)，天然？重组？ 筛选原：纯度(纯度越高越能得到高特异的抗体)？是否进行对筛？ 抗体应用：ELISA？WB？IHC？配对？竞争？ 单克隆抗体名词解释 抗体主要由机体的B淋巴细胞合成，每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，即克隆。如果选出一个合成一种抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞所合成的抗体即为单克隆抗体。 /view/117180.htm?fr=ala0_1 单克隆抗体制备的基本原理与过程？有什么意义？ 哈哈~我们刚考到这题 原理： B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。B细胞的这种能力和量是有限的，不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。 过程 1）免疫脾细胞的制备 制备单克隆抗体的动物多采用纯系 Balb/c小鼠。免疫的方法取决于所用抗原的性质。免疫方法同一般血清的制备，也可采用脾内直接免疫法。 2）骨髓瘤细胞的培养与筛选 在融合前，骨髓瘤细胞应经过含8-AG的培养基筛选，防止细胞发生突变恢复HGPRT的活性（恢复HGPRT的活性的细胞不能在含8-AG的培养基中存活）。骨髓瘤细胞用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养，融合前24h换液一次，使骨髓瘤细胞处于对数生长期。 3）细胞融合的关键: 1技术上的误差常常导致融合的失败。例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。 2融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。 4）阳性克隆的筛选 应尽早进行。通常在融合后10天作第一次检测，过早容易出现假阳性。检测方法应灵敏、准确、而且简便快速。具体应用的方法应根据抗原的性质，以及所需单克隆抗体的功能进行选择。常用的方法有 RIA法、 ELISA法和免疫荧光法等。其中ELISA法最简便，RIA法最准确。阳性克隆的筛选应进行多次，均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增。 5）克隆化 克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体。克隆化应尽早进行并反复筛选。这是因为初期的杂交瘤细胞是不