柳树叶提取物诱导肝癌细胞株hep-G2凋亡实验研究.docVIP

柳树叶提取物诱导肝癌细胞株hep-G2凋亡实验研究 　　摘要 目的：研究柳树叶水提物抗肿瘤作用，为最终提取一种有效抗肿瘤药物及临床前实验提供依据。方法：柳树叶水提物制备药物血清作用于培养的肝癌细胞株hep-G2，检测其凋亡。采用端粒重复序列扩增（TRAP）法结合非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测端粒酶活性。结果：柳树叶水提物制备药物血清对靶细胞有明显的抑制生长现象。孵育一段时间后，能使肝癌细胞发生凋亡，并呈现对浓度的依懒性和伴随端粒酶活性下降。结论：柳树叶提取物能诱导肝癌细胞株hep-G2凋亡。 　　关键词 柳树叶提取物 肝癌细胞株hep-G2 肿瘤细胞凋亡 实验研究 　　 　　柳树叶中含有挥发油和大量糖苷类化合物及酚类化合物，其水提浸膏早已被证实具有消炎止痛、活血化瘀的作用[1]，常用于外用药的组方中，用于治疗跌打损伤、腰肌劳损等病症，近年来还用于治疗癌性疼痛。国外有研究表明柳枝水萃取物能够显著抑制肿瘤细胞生长[2]，但机理尚不明确。本实验研究以肝癌细胞株hep-G2作为靶细胞，探讨柳树叶水提物诱导其凋亡的可行性。用柳树叶水提物对SD大鼠灌胃，制备药物血清，将药物血清加入体外培养液中进行肝癌细胞株hep-G2培养。观察药物血清对肿瘤细胞凋亡和细胞端粒酶活性的影响。 　　 　　1 材料与方法 　　 　　1．1 药物血清的制备：分述如下。 　　1．1．1 实验材料：柳树叶水提物、SD大鼠、注射器、灌胃针、解剖剪、解剖镊、无菌试管、微孔滤膜、吸管、橡皮头、台式低速离心机、冰箱、真空干燥灭菌柜。 　　1．1．2 实验步骤：①柳树叶水提物分高浓度(15mg/kg,即每千克SD大鼠灌15mg柳树叶水提物)、中浓度（10mg/kg）、低浓度（5mg/kg）对SD大鼠进行灌胃。对照组用生理盐水灌胃，每组6只SD大鼠。②3周后于无菌条件下分别打开灌胃过的SD大鼠腹腔，由下腔静脉抽血，同组大鼠血装于事先编号的同一无菌试管内，混匀。血液在室温下放置3h，使血液凝固，然后移至4℃冰箱中过夜，使血清充分析出。③第2天将各试管血清在4℃，4000r/min条件下离心20min,使血清析在上层，吸取另装，然后用0．22um的微孔滤膜过滤除菌，再放于真空干燥灭菌柜里53℃灭火30min后???保存于-20℃冰箱待用。 　　1．2 细胞培养：分述如下。 　　1．2．1 实验材料：超净台（TH-420）、二氧化碳培养箱（For ma311）、低速台式离心机（Beckman）、倒置显微镜（SANYO）、培养瓶、无菌吸管、橡皮头、试管架、酒精灯、酒精棉球、废液缸、标记笔、灭菌工作服、口罩、帽子、磷酸盐缓冲液（PBS）、细胞消化液（0．25%胰蛋白酶）、细胞培养液（含10%小牛血清的RPMI1640完全培养基）、含100ml/L药物血清和对照血清的RPML1640培养液、肝癌细胞株hep-G2、细胞计数板。 　　1．2．2 实验步骤：①将药物血清和对照血清分别配成100ml/L的RPML1640培养液备用。②将hep-G2细胞培养于RPMI1640培养液中放于二氧化碳培养箱（37℃，5%CO?2，饱和湿度）中培养。③从培养箱中取出培养瓶，显微镜下观察。当细胞培养瓶中的细胞长成致密单层时，在酒精灯旁打开瓶塞，倒去瓶中旧培养液，加入1~2ml 0．25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准），室温静置2~10min,于倒置显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状时则吸去胰蛋白酶液，加入新培养液。用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，直至瓶壁细胞全部脱落下来为止。再轻轻吹打细胞悬液，使细胞分散，吸取1ml细胞液，将细胞液滴于细胞计数板上记数。将剩余细胞悬液吸入10ml离心管中。平衡后，将离心管放入台式离心机中，以1000r/min离心5min。弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液，根据记数结果将细胞悬液分装于2~3个培养瓶中，使每个培养瓶接种上约106个细胞，再加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内，放入培养箱中培养，预培养24h。然后分别换药物血清培养液和对照组培养液培养6d。将经药物血清作用过的hep-G2分成两份，一份采用Annexin-v法对肝癌细胞进行Annexin-v和PI双染色，上流式细胞仪检测，观察药物血清对肿瘤细胞凋亡的影响。再采用端粒重复序列扩增（TRAP）法，对另一份hep-G2进行检测，观察药物血清对体外培养的hep-G2的端粒酶活性的影响。 　　1．3 细胞凋亡检测：分述如下。 　　1．3．1 实验材料：流式细胞仪（Bdlsrfsc）?低速台式离心机（Beckman）?吸管?试管?离心管?试管架?PBS液?Annexin V/PI试剂盒。 　　1．3．2 实验步骤：将经药物血清培养