第四章 固定化酶与固定化细胞1.pptVIP

个别情况下，酶固定化后比游离酶酶活提高，其原因可能是： 偶联过程中酶得到化学修饰； 酶对抑制剂的结合能力降低； 酶分子的抑制因子被去除； 由于载体原因，是的底物分子在酶分子的周围富集，提高酶活力。 2. 稳定性的影响 热稳定性、pH稳定性提高； 保存稳定性好，可以在一定条件下长期保存； 对蛋白酶的抵抗性增强，不易被其水解； 对变性剂的耐受性提高。 固定化酶稳定性提高的可能原因 ① 固定化增加了酶活性构象的牢固程度， 可防止酶分子伸展变形； ② 抑制酶的自身降解（自降解酶）。 ③ 固定化部分阻挡了外界不利因素对酶的侵袭。 eg.南极假丝酵母脂肪酶的最适温度为40℃，Novo（诺维信）公司将其固定化在聚丙烯酸树脂上，可以耐受80-100℃高温。 3. 最适温度的变化 由于固定化后酶的热稳定性提高，所以，最适温度一般也随之提高。 eg.用壳聚糖固定化胰蛋白酶，其最适温度是80℃，比固定化前提高了30℃。其具有很大的工程应用价值！ 第一章 酶工程基础 《酶工程》 授课人：任杰（173138232） 第四章 固定化酶与固定化细胞 为什么要固定化酶？ 可提高酶的稳定性； 可反复多次使用，节省成本； 简化后续分离纯化步骤。 为什么要固定化细胞？ 偷懒 很多催化工程是复杂的，不是一两种酶就能完成。 本 章 内 容 酶的固定化 细胞固定化 辅酶固定化 什么是固定化酶？ 水溶性酶 水不溶性载体 水不溶性酶 （固定化酶） 固定化技术 固定化酶的基本要求 尽可能保持酶的催化活性和专一性； 载体结合牢固、稳定性好、并具有一定机械强度； 空间位阻小； 成本尽可能低； 酶的固定化 酶的固定化 吸附法 包埋法 吸附共价结合法 交联法 无载体固定化 不同方法联用 固定化方法 吸附法通常利用氢键、离子键和疏水作用的原理，将酶固定于水不溶载体上的固定化方法。 分为物理吸附法和离子交换吸附法。 物理吸附法：常用作用力有范德华力、氢键、疏水作用。 优点：操作简单，反应条件温和，可以反复使用。 缺点：酶与载体结合力弱，酶易脱落并污染产品。 酶的固定化 固定化方法 吸附法 常用的载体有： 有机载体。纤维素、骨胶原、火棉胶及面筋、淀粉等。比如用膨润的玻璃纸或胶棉膜吸附木瓜蛋白酶、碱性磷酸脂酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶。吸附后在载体表面形成单分子层，吸附蛋白能力约70mg / cm2。 无机载休。氧化铅、皂土、白土、高岭土、多孔玻璃、二氧化钛等。比如用多孔硅为载体吸附米曲霉和枯草杆菌的淀粉酶以及黑曲霉的糖化酶，在45℃进行固定化，用高浓度的底物进行连续反应．半衰期分别为14、35、60d。无机载体的吸附容量较低、而且酶容易脱落。 离子交换吸附法：将酶与含有离子交换基的水不溶载体相结合而达到固定化的一种方法。 常用的载体有阴离子交换剂：如二乙基氨基乙基(DEAE)-纤维素、混合胺类(ECTEDLA)-纤维素、四乙氨基乙基(TEAE)-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、Amberlite IRA-93、410、900等。 阳离子交换剂：如羧甲基(CM)-纤维素、纤维素柠檬酸盐、Amberlite CG50、IRC-50、IR-200、Dowex-50等。 优点：操作简单，反应条件温和，制备出的固定化酶活性高。 缺点：酶与载体结合不牢固，不适应高浓度底物、高离子强度。 包埋法是将酶分子截留在具有特定网状结构载体中的一种固定化方法，无需蛋白中的残基与载体结合。 酶的固定化 固定化方法 包埋法 包埋法 1. 凝胶包埋法 2. 纤维包埋法 3. 半透膜包埋法 a. 聚丙烯酰胺包埋法 b. 海藻酸钙包埋法 c. 琼脂凝胶包埋法 将酶和高聚物（醋酸纤维素、聚乙烯等）的 有机溶剂（二氯甲烷）溶液先乳化，在通过 喷头挤压入凝结液中，形成纤维状包埋体。 半透膜包埋法制成的固定化酶小球。 优点：操作简单、酶本身活性保留高； 缺点：凝胶网格阻碍不利于大分子底物和产物的酶固定化，其 这种阻碍会导致酶动力学变化大，及酶表观活力降低。 酶液 丙烯酰胺 N，N－双丙烯酰胺 引聚剂： 过硫酸铵、核黄素 光照 聚合反应 凝胶酶块 固定化酶 切割 以丙烯酰胺为材料进行包埋酶为例： 酶分子与载体之间以共价键作用而实现结合的固定化方法。 其原理就是酶分子表面的功能基团与载体表面的功能基团发生化学反应形成共价键。 酶的固定化 固定化方法 共价结合 共价结合法 1. 溴化氰法 2. 乙基氯甲酸酯法 3. 碳二亚胺法 4. 重氮法 5. 3-氨基丙基三乙基氧硅烷法 6. 戊二醛活化法 7. 叠氮法 优点：操作繁琐，反应条件激烈，酶容易失活； 缺点：酶与载体结合牢固，酶分子不易脱落。 将带芳香族氨基的载体，先用NaNO2和稀盐酸处理成重氮盐衍生物，再在中性偏碱(pH8-9)条件下与酶蛋白发