硅胶柱层析分离的实验原理法与技巧.docx

硅胶柱层析分离的实验原理、方法与技巧一、硅胶柱层析原理硅胶层析法的分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而得到分离，一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附，整个层析过程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸过程。硅胶柱层析流动相极性小的用乙酸乙酯： 石油醚系统； 极性较大的用甲醇： 氯仿系统；极性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统；拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸硅胶柱层析惯用方法1.称量。 200-300 目硅胶，称 30-70 倍于上样量；如果极难分，也可以用 100 倍量的硅胶 H。干硅胶的视密度在 0.4 左右，所以要称 40g 硅胶，用烧杯量 100ml 也可以。2.搅成匀浆。加入干硅胶体积一倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌。如果洗脱剂是石油醚 /乙酸乙酯 /丙酮体系，就用石油醚拌；如果洗脱剂是氯仿 /醇体系，就用氯仿拌。如果不能搅成匀浆，说明溶剂中含水量太大，尤其是乙酸乙酯/丙酮，如果不与水配伍走分配色谱的话，必须预先用无水硫酸钠久置干燥。氯仿用无水氯化钙干燥，以除去1% 的醇。如果样品对酸敏感，不能用氯仿体系过柱。3.装柱。将柱底用棉花塞紧，不必用海沙，加入约1/3 体积石油醚（氯仿），装上蓄液球，打开柱下活塞，将匀浆一次倾入蓄液球内。随着沉降，会有一些硅胶沾在蓄液球内，用石油醚（氯仿）将其冲入柱中。4.压实。沉降完成后，加入更多的石油醚， 用双联球或气泵加压，直至流速恒定。 柱床约被压缩至 9/10 体积。无论走常压柱或加压柱，都应进行这一步， 可使分离度提高很多， 且可以避免过柱时由于柱床萎缩产生开裂。5.上样。干法湿法都可以。海沙是没必要的。上样后，加入一些洗脱剂，再将一团脱脂棉塞至接近硅胶表面。 然后就可以放心地加入大量洗脱剂，而不会冲坏硅胶表面。6.过柱和收集。 柱层析实际上是在扩散和分离之间的权衡。太低的洗脱强度并不好，推荐用梯度洗脱。收集的例子：10mg 上样量，1g 硅胶 H，0.5ml 收一馏分； 1-2g 上样量，50g 硅胶（200-300 目），20-50ml 收一馏分。7.检测。要更多地使用专用喷显剂，如果仅用紫外灯，会损失较多产品，紫外的灵敏度一般比喷显剂底1-2 个数量级。8.送谱。收集的产品旋干，在送谱前通常需要重结晶。如果样品太少或为液体，可过一小凝胶柱， 作为送谱前的最后纯化手段。可除去氢1.5ppm 左右所谓的 “硅胶 ”峰。二、柱层析分离的实验方法和技巧常说的过柱子应该叫柱层析分离，也叫柱色谱。我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。 由于柱分的经验成分太多， 所以下面我就几年来过柱的体会写些心得，希望能有所帮助。一：柱子可以分为：加压，常压，减压压力可以增加淋洗剂的流动速度， 减少产品收集的时间， 但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候， 常压柱是效率最高的，但是时间也最长，比如天然化合物的分离，一个柱子几个月也是有的。减压柱能够减少硅胶的使用量， 感觉能够节省一半甚至更多， 但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发 （有时在柱子外面有水汽凝结），以及有些比较易分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用水泵抽气（很大的噪音，而且时间长） 。以前曾经大量的过减压柱，对它有比较深厚的感情， 但是自从尝试了加压后， 就几乎再也没动过减压的念头了。加压柱是一种比较好的方法， 与常压柱类似， 只不过外加压力使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气， 双连球或者小气泵（给鱼缸供气的就行）。特别是在容易分解的样品的分离中适用。压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。 个人觉得加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。二：关于柱子的尺寸应该是粗长的最好。柱子长了，相应的塔板数就高。柱子粗了，上样后样品的原点就小（反映在柱子上就是样品层比较薄），这样相对的减小了分离的难度。试想如果柱子十厘米，而样品就有二厘米，那么分离的难度可想而知， 恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。而如果样品层只有0.5 厘米，那么各组分就比较容易得到完全分离了。当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了，不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了（有些不环保的说， 不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费） 。现在见到的柱子径高比一般在 1：5～ 10，书中写硅胶量是样品量的 30～ 40 倍，具体的选择要具体分析。如果所需组分和杂质分的比较开（是指在所需组分 rf 在 0.2～ 0.4，杂质相差 0.1 以上），就可以少用硅胶，用小柱子（例如 200 毫克的样品，用 2cm× 20cm 的柱子）；如果相差不到 0.1，就要加大柱子，我觉得可以增加柱子的直径，比如用 3cm 的，也可以减小淋洗剂的极性等等。三：关于无水无氧柱适用于对氧，水敏感，易分解的产品，可以湿柱，也可以干柱。不过在样品之