现代生物技术作业3.doc

1.设计抗除草剂转基因黄豆的研究方案 首先：获得抗除草剂基因 这个基因目前比较普遍，一般很多载体上都有，你如果觉得不好，或者想自己发明一种新的抗除草剂基因亦可以自己调取 其次：将获得的抗除草剂基因连接到植物表达载体中！ 选择合适的双子叶植物表达载体，如pBI121等，其多克隆位点前启动子为35s等双子叶植物强启动子，设计合适的酶切位点，构建用于在大豆中表达的植物表达载体！ 之后：将重组载体转入黄豆中 大豆的转基因技术比较成熟，从农杆菌转化法到基因枪法以及PEG法等等。以最常规的农杆菌转化法为例，首先需要一套完整的大豆外殖体培养繁殖体系，能使得从受伤的叶片，产生愈伤组织，分化出不定芽，分化出根，炼苗，移植，生长成成熟植株。其次，需要合适的农杆菌，例如EHA105，将重组载体转入农杆菌感受态中。最后，建立合适的农杆菌转化体系，可能需要特殊的激素，以及辅助的小分子物质等，这方面的文章海了去了！ 最后：转基因植株的鉴定 一般表达载体上会带有自己的表达标签，因此用载体上的标记，如Kan或者GUS作为标记，再看看能够抗除草剂，如果这两者都是阳性的那么一般来说就转基因成功了，具体的分子生物学鉴定是：1：Southern检测，2：RT-PCR检测，3：T3代纯系检测！ 1.细胞的全能性 2.转录和翻译分开进行 3.有相当大的非编码区（调控序列）4.有三种不同RNA聚合酶参与转录5.初级转录产物能进行剪接加工修饰6.不存在操纵子结构7.基因多拷贝，功能基因分散在不同区域，分别转录 真核表达系统 1酵母2丝状真菌3昆虫4哺乳动物细胞5转基因动物6植物反应器 1酵母表达系统的优缺点 遗传背景清楚（基因组是大肠杆菌的3.5倍） 增殖快（90min/代），培养容易，产量较高 易于研究突变与基因功能，如构建酵母人工染色体等 可以进行转录和翻译后修饰加工 提纯工艺复杂，成本高，制品纯度达不到要求，制品免疫原性差，接种剂量大 酵母载体的基本结构 DNA复制起始区：2μ质粒和自主复制序列 选择标记：营养缺陷型和显性选择（抗药） 整合介导区：同源重组，决定整合位置和拷贝数 有丝分裂稳定区：帮助载体平均分配,表达盒,转录启动子,终止子,分泌信号序列 酵母表达系统中载体的种类 按载体在酵母中的复制形式分为：1YIp：酵母整合型载体2YRp：酵母自主复制型载体3YCp：酵母含着丝粒片段载体4YEp：酵母附加体型载体5YAC：酵母人工染色体 昆虫表达系统 杆状病毒基因组：闭环双链DNA，88-166kb 启动子：杆状病毒科核多角体病毒的多角蛋白强启动子 表达系统 杆状病毒表达系统（BEVS） 家蚕核型多角体病毒-家蚕表达系统 宿主：鳞翅目、膜翅目、双翅目、鞘翅目、直翅目、脉翅目、毛翅目的600多种昆虫 克隆基因方法：转移载体→共转染→同源重组→空斑筛选→纯化→重组病毒 杆状病毒表达系统优点 容量大：能插入12kb的外源基因 高表达：polh基因启动子是目前所知的最强的真核启动子；产物对宿主影响小；产物可结晶 高效：可同时表达多个基因 安全：杆状病毒对脊椎动物无病原性 具加工修饰功能：昆虫细胞较高等 家蚕易饲养 哺乳动物细胞表达表达系统 常用宿主细胞 哺乳动物细胞常用载体 真核细胞表达元件 哺乳动物基因转移的遗传标记 基因表达的检测方法 哺乳动物细胞表达的优点 重组DNA易转染，遗传稳定，可重复识别和去除内含子 进行翻译后修饰,磷酸化、糖基化、二硫键、寡聚体等的形成、高级结构的正确折叠,产品的构型正确率高，可被改造成类人体源性，免疫源性好,可分泌至培养基，提纯工艺简单，成本低,可用于基因治疗 常用宿主细胞 细胞名称 来源 已投放产品 BHK-21 地鼠幼鼠肾 凝血Ⅷ因子 CHO-K1 中国仓鼠卵巢 tPA，Ⅷ因子，EPO，G-CSF等 C127 小鼠乳腺肿瘤 GH MDCK 长耳狗肾脏 兽用疫苗 Namalwa Burkitt淋巴瘤病人的类淋巴母细胞 EPO，LT，tPA，IFN Vero 成年非洲绿猴肾 HBsAg，GH 鼠骨髓瘤细胞 骨髓瘤 tPA，抗体 COS SV40转化的绿猴肾细胞 CD34，CD69，TGF 真核细胞表达元件 1原核DNA序列2启动子 3增强子 4拼接信号5终止子和多聚腺苷化信号6筛选标记7动物病毒基因序列 3.根据转基因豆油与非转基因豆油，转基因豆粉与非转基因豆粉的异同点，分别论述食用转基因豆油与转基因豆粉是否安全 转基因大豆油是用转基因大豆为原料加工出来的食用油目前世界上对转基因食品的安全性有较大争议，长期使用转基因产品对人体的危害性尚不明确。欧盟等一些国家已经出台了措施限制对转基因食品的进口。 转基因豆粉的遗传物质中有人为导入的基因片段，表达出我们想要的蛋白质转基因大豆里含有抗除草剂的酶。但是这些酶会像其他吃入的蛋白质一