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一种高效而经济获得长片段基因突变体方法 　　摘 要：重组PCR方法的发展为体外突变技术提供了更快捷、准确的方法。通过改进引物设计和PCR保真性等方法，应用重叠延伸PCR的原理成功地实现了对BA基因的定点突变，并构建了其含有m1，m2，m3和m4的突变体。实验证明通过这种改进方法可以有效地进行长片段基因的突变，并且这种方法与其他方法相比具有简便、快捷、经济、高效的特点。 　　关键词：定点突变；重叠延伸PCR(OE PCR)；基因 　　中图分类号：Q785 　　文献标识码：A 　　文章编号：1007―7847(2006)01―0034―05 　　体外定点突变技术是研究基因、蛋白质结构 和功能之间复杂关系的有力工具，也是实验室中 改造或优化基因常用的手段。缺失、插入或替换 特定碱基的定点突变可用不同的方法来实现。目 前已报道的以PCR为基础的各种诱变方法中， “重叠延伸法”和“大引物法”比较突出，在此 基础上发展的“一步PCR方法”也有一定的应用 范围。这些方法虽然都有各自的优点，但其诱变 率却不理想。 　　本研究中突变的基因(BA)长度较大(3，0 kb)，我们拟将它的4个丝氨酸(Ser)位点(m1， m2，m3和m4)通过碱基置换变为编码丙氨酸 (AIa)的位点，预突变的位置都位于基因中后段， 综合这些特点，本研究通过改进引物设计和PCR 保真性等方法应用重叠延伸PCR(overlap exten- sionPCR，OEPCR)原理实现了对BA基因的定点 突变并构建了突变体。实验证明了此种改良方法 简便、快捷、经济而又突变准确，尤其适用于长片 段基因的定点突变。 　　 　　1 材料和方法 　　 　　1．1 材料 　　T4DNA连接酶购自NEB公司，T4DNA聚合 酶，限制性内切酶KpnI、XhoI与dNTPs及凝胶 纯化回收试剂盒(DV805A)均购自TaKaRa公司， 引物合成于TaKaRa公司，PfuUltraTMDNA高保真 聚合酶购自Stratagene公司，pOTB7-BA质粒， 克隆载体pcDNA3，1 HisA购自lnvitrogen公司。 　　 　　1．2 方法 　　自行设计的在BA基因开放阅读框两端的引 物Pa／Pb，通过分别引入限制性酶切位点KPnI 和Xho I可将其导人载体pcDNA 3．1 HisA．引 物如下： 　　OEPCR分为三轮，第一轮以质粒pOTB7―BA 为模板利用引物Pa即BA基因开放阅读框外侧 5，上游引物与突变点3’下游引物PmR(mutation reverseprimer)(PmlR，Pm2R，Pm3R或Pm4R)，第 二轮仍以质粒pOTB7-BA为模板利用引物Pb即 BA基因开放阅读框外侧3’下游引物与突变点5’ 上游引物PmF(mutation forward primer)(PmlF， Pm2F，Pm3F或Pm4F)。第一、二轮的PCR产物经 纯化回收后以摩尔比1：1为模板利用引物Pa／Pb 进行第三轮的重叠延伸PCR，变性后的PaPmR和 PbPmF段在重叠区域退火，进行延伸形成全长的突 变双链DNA。因第一、二轮的PCR产物在拟突变点 左右有重叠，故此称为重叠延伸PCR(见图1)。 　　突变引物PmlF／PmlR，Pm2F／Pm2R，Pm3F／ Pm3R，Pm4F／Pm4R分别设计在这4个拟突变位 点的两侧，并且每对引物之间有一定的重叠碱基， 重叠的碱基数都在2t bp以上(见表1)。 　　PCR反应体系如下：在每个PCR体系中，模板 20ng，dNTPs0．2mmol／L，镁离子1．5mmol／L，每 种引物10μmol／L，PfuUltraTMDNA高保真聚合酶 0．025 U，对于所有的PCR反应，均是94℃预变 性3 min，执行下述30个循环之后，72℃延伸10 rain，4℃保存。PCR反应条件见表2， 　　直接用引物Pa与Pb扩增出BA野生型(BA wildtype，BAwt)转入载体作为试验的对照。BA wt和4个不同突变体的PCR产物经琼脂糖电泳、 纯化回收及双酶切(kpI和XhoI)与双酶切载 体pcDNA3．1 HisA(KpnI和Xh01)连接，4℃连 接过夜，转化人大肠杆菌DH5a。采用含氨苄青霉 素(50mg／L)的LB平板筛选白斑，酶切鉴定筛选 阳性克隆。 　　 　　1.3 测序 　　核苷酸序列的测定采用Sanger双脱氧末端 中止法，在ABl373ADNA序列测定仪上测序，此 项工作由上海生工测序部完成。 　　 　　2 结果 　　 　　对于这4个突变体，每一轮PCR扩增出的产 物都可见清晰的特异性条带，片段大小都与预期 的理论值相符(图2、3、4) 　　对于重组质粒BA－pcDNA 3