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三裂叶野葛毛状根生长及其培养基营养物质消耗变化 　　摘 要：研究了发根农杆菌(Agrobacterterium rhizogenes)ATCC15834遗传转化产生的三裂叶野葛(Pueraria phaseoloides)毛状根在液体培养过程中生长及其部分营养物质消耗的关系，结果表明：三裂叶野葛毛状根液体培养0－4d内处于生长迟滞期、8－16d为快速生长期、16d后进入生长平台期，培养基的PO4、硝态氮和铵态氮在毛状根液体培养过程中被逐渐吸收和消耗，培养16d时培养基中的PO4被消耗殆尽，其浓度仅为培养基起始PO4浓度的0.26％；培养基的铵态氮和硝态氮则在培养20d时才消耗殆尽；而培养基中的ca2+浓度在培养过程中逐渐降低，但在培养20d时仍未被完全消耗，其浓度约为起始浓度的30.5％，培养基的pH值随培养时间的延长而不断降低，培养20d后pH值由5.62降低到4.09；而毛状根的颜色也随培养基pH值的降低和培养时间的延长逐渐由白色变成浅黄色和浅褐色，该结果为今后设计合适的培养基以开展野葛毛状根的大规模液体培养来生产葛根素提供了可能性。 　　关键词：三裂叶野葛；毛状根；ca2+；氮源；磷酸盐 　　中图分类号：Q945 　　文献标识码：A 　　文章编号：1007-7847(2007)01-0052-06 　　利用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)Ri (root inducing)质粒遗传转化产生的可自主生长 的毛状根培养物来生产药用植物的次生物质，已 在人参(Panax ginseng)、丹参(Salvia miltiorrhiza)和青蒿(Artemisia annua)等多种药用植物中获得成功，三裂叶野葛(Pueraria phaseoloides)是豆科葛属的药用植物之一，其根部所含的葛根素、大豆甙等异黄酮类化合物，具有解毒退热、抗心律失常及改善心脏的血液循环等功效以及具有类似雌性激素的作用，我们曾利用发根农杆菌ATCC15834对三裂叶野葛的遗传转化，获得了能在无激素的培养基上自主生长，又能产生葛根素的毛状根，但如何建立该毛状根离体培养的最佳培养条件，就成为利用该毛状根批量培养或发酵培养来生产葛根素等药用次生物质的基础及前提条件。 　　植物毛状根培养所用的培养基一般由无机元素、有机附加物等组成，已往的研究表明，培养基的重要组成成分如无机营养元素等的变化能影响植物悬浮细胞培养物以及毛状根的生长及其次生代谢物的产???，但有关这些组分在培养基中的代谢变化及其与毛状根的生长、形态变化等方面的研究较少，本文通过对三裂叶野葛毛状根液体培养过程中培养基无机元素N、Ca和P消耗的研究以及培养过程中培养基pH值变化的测定，来确定三裂叶野葛毛状根液体培养周期中氮源和无机元素的用量，为今后开展三裂叶野葛毛状根大规模培养中氮源和无机元素的及时补充和起始浓度的确定等提供参考。 　　 　　1 材料和方法 　　 　　1.1 供试材料与培养基 　　以发根农杆菌(A.rhizogenes)ATCC15834诱导三裂叶野葛叶片外植体产生的、能在无外源激素培养基上自主生长又能产生葛根素的毛状根为培养材料，有关该毛状根的诱导方法见文献[6]，所用的培养基为MS液体培养基，其中蔗糖浓度为30g/L，灭菌前培养基的pH5.8，高压蒸汽灭菌后，其pH值为5.62，另外，采用在MS培养基中添加10mmol/L MES[2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid](pH值稳定剂)来比较pH值的变化对三裂叶野葛毛状根液体培养的影响。 　　 　　1.2 毛状根液体培养及其生长的测定 　　将来自同一克隆系的生长旺盛的三裂叶野葛毛状根切成长4-5cm、具根尖的毛状根根段，接种至盛有50mL不加MES的MS液体培养基的250mL三角瓶中，毛状根起始接种量为0.2g鲜重／瓶，将培养瓶置于转速为110r/min旋转式摇床中，于黑暗、(25±2)℃下振荡培养，在为期20d的培养过程中，每隔4d随机抽取毛状根培养物各4瓶，用无菌水冲洗2次后、用滤纸吸干毛状根培养物表面的水分后，进行毛状根生长量(干重)测量；同时，取出毛状根培养物后的培养基经滤膜过滤后，滤液保留于超低温冰箱中，供培养基中N、P和Ca消耗量的测定及pH值变化的测定用。 　　 　　1．3 培养液中NO3、NH4和PO4含量的测定 　　当毛状根接种至液体培养基后，分别在培养后的4、8、12、16和20d取残余培养基过滤、去离子水定容后，测定其NO4、NH4、Ca2+和PO4含量的变化，其中，培养基中硝态氮和磷酸盐含量的测定按张志良等(2003)的方法；培养基中铵态氮的测定按照参考文献[13]的方法进行；而培养基中Ca2+浓度的ED