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不溶性草酸氧化酶部分纯化研究 　　摘要：以大麦麦麸为原料，对不溶性草酸氧化酶进行了部分纯化，比较了酶法与滴定法测定草酸的方法。结果表明，粗酶经酸热变性、淀粉酶水解、ＮａＣｌ洗涤、去离子水洗涤４个步骤的纯化后，不溶性草酸氧化酶的纯化倍数为１．５１；酶法与滴定法测定草酸无显著性差异。该技术有望用于草酸检测试剂盒的开发。 　　关键词：麦麸；不溶性草酸氧化酶；部分纯化 　　中图分类号：Ｑ８１４．９文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）14－2943-02 　　 　　Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｐａｒｔｉａｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｕｎｓｏｌｕｂｌｅ Ｏｘａｌａｔｅ Ｏｘｉｄａｓｅ 　　 　　ＺＨＡＮＧ Ｍｅｎｇ－ｃｈｅｎｇ，ＸＵ Ｃｈｕｎ－ｈｕｉ，ＨＵ Ｙｉ－ｈｏｎｇ 　　（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｈｕｎａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｕｍａｎｉｔｉｅｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｌｏｕｄｉ ４１７０００， Ｈｕｎａｎ，Ｃｈｉｎａ） 　　 　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Tｈｅ ｐａｒｔｉａｌ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｓｏｌｕｂｌｅ ｏｘａｌａｔｅ ｏｘｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ ｂａｒｌｅｙ ｂｒａｎ was explored. And ｔｈｅ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｕｓｉｎｇ ｕｎｓｏｌｕｂｌｅ ｏｘｉｄａｓｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ for ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｏｘａｌｉｃ ａｃｉｄ ｃｏｎｔｅｎｔ was compared． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｗａｓ ｐｕｒｉｆｉｅｄ １．５１－ｆｏｌｄ after ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ ａｃｉｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ， ｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇ ｗｉｔｈ ａｍｙｌａｓｅ， ｗａｓｈｉｎｇ ｗｉｔｈ ＮａＣｌ ａｎｄ ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ． Ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ??ｅｔｈｏｄ ｏｆ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｗｈｅａｔ ｏｘａｌｉｃ ａｃｉｄ． Ｔｈｉｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｃould ｂｅ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｏｆ ｏｘａｌａｔｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ． 　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｂａｒｌｅｙ ｂｒａｎ； ｕｎｓｏｌｕｂｌｅ ｏｘａｌａｔｅ ｏｘｉｄａｓｅ； ｐａｒｔｉａｌ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ 　　 　　草酸检测广泛应用于食品、养殖等行业对原料的质量鉴定，常采用色谱法、滴定法和酶法。其中酶法检测最为快捷，成本低，应用前景广阔［１，2］。酶法检测通常采用草酸氧化酶（Ｏｘａｌａｔｅ ｏｘｉｄａｓｅ，ＯｘＯ）与ＰＯＤ偶联，检测草酸氧化产生的Ｈ２Ｏ２的量以确定草酸含量。该试验采用市售大麦麸皮为原料，对不溶性ＯｘＯ进行部分纯化，旨在建立低成本制备ＯｘＯ的方法，达到廉价、快速测定草酸的目的。 　　１材料与方法 　　１．１材料 　　市售大麦麸皮；小麦品种烟优３６１，青岛农业大学提供；４－氨基氨替吡啉，Ｓｉｇｍａ公司；其他试剂均为国产分析纯。 　　１．２方法 　　１．２．１不溶性ＯｘＯ的部分纯化磨碎大麦麸皮，经２００目过筛，称取过筛物５０ ｇ，加入等体积的０．１ ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ值为３．８的琥珀酸溶液，７０ ℃水浴１５ ｍｉｎ。5 000 g离心５ ｍｉｎ，去除析出的黏稠物，５０ ℃烘干，加入等体积０．１ ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ值为６．８的磷酸缓冲液、２ ｇ淀粉酶，３７ ℃保温１ ｈ，离心收集沉淀；加入等体积的１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ溶液３０ ℃保温１ ｈ，同样方法离心收集沉淀。去离子水淋洗３次，离心收集沉淀，５０ ℃烘干沉淀，研磨后经２００目过筛，过筛物即为部分纯化的不溶性ＯｘＯ，置于干燥皿中备用。 　　1.2.2测定方法 　　1）ＯｘＯ活性测定。参照刘娥娥等［３］的方法，１ ｍＬ反应体系中含４－氨基氨替吡啉０．４ ｍｇ，５ Ｕ ＰＯＤ，６ ｍｇ琥珀酸，０．２５ μＬ Ｎ，Ｎ－二甲基苯胺，７５％乙醇，用ＮａＯＨ调整ｐＨ值至３．８，加入５０ ｍｇ不溶性ＯｘＯ，以０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ的草酸启动反应，不加草酸的反应体系为空白，测定３０ ｍｉｎ后的ＯＤ５５５。以室温下每分钟产生１ μｍｏｌ Ｈ２Ｏ２为１ Ｕ。 　　 2）Ｈ２Ｏ２生成检测。采用显色液检测ＯｘＯ在无草酸条件下是否有红色物质生成。 　　 3）ＰＯＤ、ＣＡＴ活性测定。采用张龙翔等［４］的方法测定。