人HTRIE基因在不同细胞系和多种组织中表达及其功能.docVIP

人HTRIE基因在不同细胞系和多种组织中表达及其功能 　　摘　要：人的HTRIE基因是五羟色胺受体(HTR)家族中的一员，这个家族里面的基因都和精神分裂症、抑郁症以及人的自杀活动有关，但是对于其具体的作用机制目前研究不多，采用实时定量PCR方法分析了HTRIE基因在各个组织和不同细胞系中的表达情况，亚细胞定位发现HTRIE位于细胞膜上，萤光素酶实验分析确定HTRIE可以抑制原癌基因erbB2启动子的转录活性，这些研究结果为进一步研究HTRIE基因在疾病发生中的作用奠定了一定的基础。 　　关键词：HTRIE；表达谱；实时定量PCR：转录活性 　　中图分类号：Q7　文献标识码：A　文章编号：1007-7847(2007)04-0311-05 　　 　　人类的五羟色胺受体可以分为7种类型，即5-HTRI～7，这7种类型又可以分为14种亚型，分别为：HTR1A，HTR1B，HRTIC，HTRID，HTRIE，HTI1F，HTR2A，HTR2B，HTR2C，HTR3A，HTR4，HTR5A，HTR6，HTR7，有研芋云表明HTR7和HTR4都可以激活转录因子固醇反应元件(serumresponse element，SRE)的转录活性，在NIE-115细胞系中过表达5-HT4(a)可以使其变圆，在海马神经元中，HTR7有使神经轴突变长的功能，HTRlB能够和S100A10，Pll(annexin 2 lightchain)蛋白质发生相互作用，而且发现HTRlB对下游ERK1/2的Thr202/TYr204磷酸化具有调控作用，而且可以通过和pll相互作用抑制神经冲动的传导，人HTRIE基因位于染色体的6q14-q15，并且含有7个跨膜结构域，因此属于G-蛋白偶联受体家族，目前发现此蛋白质在背根神经中枢有表达，并且具有抑制cAMP的形成，而且在去甲肾上腺素、肾上腺素、组氨、多巴胺和褪黑激素的刺激下，其蛋白质的表达情况没有任何变化，研究发现在阻断剂methiothepin的刺激下，HTRlE抑制cAMP的形成作用消失，有研究表明，五羟色胺诱导钙离子释放是通过激活HTR1E来实现的，而且发现HTtR1E可以调节细胞因子IL-6和CXCL8/IL8的释放，因此HTR1E可能在激活各种细胞信号途径以及调节细胞因子的释放起到了很重要的作用，我们通过对HTRIE基因在各个组织和细胞系中的表达情况以及亚细胞定位分析，为以后对HTRIE功能的研究打下基础。 　　 　　1　材料与方法 　　 　　1．1　材料 　　真核表达载体pEGFP-C3和含有erb B2启动子的报告基因pTAL-luc-erbB2购自Clontech公??，pMDl8-T载体、不含erbB2启动子区域的报告基因的载体pTAL-luc、各种限制性内切酶、T4DNA连接酶、T4聚合酶及反转录试剂盒购自TaKaRa，LipofectamineTM 2000转染试剂盒，总RNA提取的TRIZOL试剂购自Invitrogen，luciferase assay试剂盒购自Promega，SYBRGreen I荧光染料实时定量PCR试剂盒购自Applied Bio systems公司，倒置荧光显微镜为Zeiss产品，PE全自动荧光定量PCR仪为美国ABI 7900产品，荧光分光光度计TD-20/20为美国产品，T47D、HeLa、HepG2、Hep3B、SW480、MCF7等14种细胞系以及人的各种组织由实验室保存。 　　 　　1．2　方法 　　1．2．1　细胞培养、总RNA的提取、cDNA的合成T47D、HeLa、HepG2、Hep3B、SW480、MCF7等细胞在37℃，5％CO2，相对湿度95％条件下，用完全培养液DMEM(补加10％新生牛血清、2mol/L谷氨酰胺和100mg/L青霉素和100mg/L链霉素)培养，24h以后用PBS将细胞洗两次，然后用细胞刮收集细胞，各种细胞系和组织按照Invitrogen公司试剂盒提供的方法进行，用反转录试剂盒合成各细胞系和组织的cDNA片段。 　　1．2．2　目的基因的扩增以及重组载体的构建 　　从人大脑组织中提取RNA，然后以反转录的cDNA为模板，以HTRIE引物对(sense primer：5′-CTCGAGATGAACATCACAAACTGTACCAC-3′，添加Xho I位点anti-sense primer 5′-GGTACCCTAAGTATGCTCTCGGCATCT-3′，添加gpn I)克隆人HTRlE编码序列(1098bp)，然后亚克隆到pMDl8-T载体中，用Xho I/Kpn I酶切鉴定正确后，用Xho I/Kpn I酶切将目的片段切下，再亚克隆到同样酶切处理的pEGFP-C3表达载体中，酶切验证后测序分析