人sTNFR1基因克隆以及在NIH3T3细胞中稳定表达.docVIP

人sTNFR1基因克隆以及在NIH3T3细胞中稳定表达 　　摘 要：以Hela细胞的总RNA为模板，用RT－PcR方法扩增sTNFR1全编码区基因片段，构建含有目的片段的T载体克隆及真核表达载体pcDNA3.1(一)重组质粒亚克隆，将重组质粒和脂质体共同转染NIH3T3细胞系，G418筛选稳定转染细胞株，经核苷酸序列测序和酶切鉴定，成功构建了pcDNA3.1(－)－sTNFR1真核表达质粒，脂质体法建立了高效表达sTNFR1的稳定转染细胞系，并经RT－PCR和Westem Blotting鉴定，人sTNFR1基因能在NIH3T3细胞系中稳定表达，为今后的研究打下了基础。 　　关键词：人可溶性肿瘤病坏死因子受体1；克隆；真核表达；稳定转染 　　中图分类号：R575.3 　　文献标识码：A 　　文章编号：1007－7847(2007)01－0078－06 　　 　　肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factor，TNFα)是体内重要的免疫调节因子和炎症介质，它的生物学作用通过受体介导，TNFα过量表达与败血症休克、暴发性肝炎、类风湿性关节炎和移植后的排斥反应等疾病的发生有密切相关，而TNFα的可溶性受体(sTNFR1)可中和TNFα的毒性作用，因此sTNFR1有潜在的临床应用价值，本文拟构建sTNFR1的真核表达载体，并在NIH3T3中表达，为下一步sTNFR1用于基因治疗奠定基础。 　　 　　1 材料与方法 　　 　　1.1 材料 　　1.1.1 菌种、细胞株与质粒 　　JM109由我室保存，人Hela细胞株和小鼠成纤维细胞(NIH3T3)由中南大学肿瘤研究所提供，pGEM-T载体购自Promega公司，真核表达质粒pcDNA3.1(-)购自美国Invitrogen公司． 　　1.1.2 酶及主要试剂 　　TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、BamH I、EcoR I、DNA回收纯化试剂盒、质粒提取试剂盒购自TakaRa公司，MMLV逆转录酶购自Promega公司，脂质体转染剂Lipofactamine 2000购自美国Invitrogen公司，TRIzol Reagent RNA分离液、DMEM(高糖)、新生牛血清和G418购自美国GIBCO BRL公司，兔抗人sTNFR1多克隆抗体购自PEPROTECH公司，Western-blotting检测试剂盒购自博士德公司，ECL试剂盒购自Amersham公司，常用试剂为国产或进口分析纯。 　　1.1.3 引物 　　GAPDH引物：购自北京鼎国生物公司，上游引物序列：5′ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC3′;下游引物序列：5′TCC ACC ACC CTG TTGCTG TA 3′，目的片段452 bp，人sTNFR1扩增用PCR引物参照其cDNA[7]设计，由上海博亚公司合成，上游引物：5′-GAA TCC ATG GAT AGT GTGTGT CCC C-3′;下游引物：5′-GTC GAC GGA TCCTCA AAT GAT CAG GGG CAA C-3′， 　　1.1.4 仪器 　　核苷酸测序使用AB1377全自动测序仪及配套的BigDye Terminator试剂盒，由博亚公司完成，Tannon Gis凝胶分析系统为上海天能公司产品， 　　 　　1.2 方法 　　1.2.1 RT-PCR扩增sTNFR1目的片段 　　自Hela细胞中提取总RNA作为逆转录模板，采用RT-PCR方法扩增sTNFR1基因，逆转录反应条件参照MMLV逆转酶说明书进行：取总RNA 3μg，Oligo(18)0.5μg，Oligo(18)0.5μg，加DEPC水至总体积12μL，70℃5 min后，立即置于冰上；然后加入5×RT Buffer 5μL，dNTP12.5nmol，RNA酶抑制剂25U，MMLV逆转录酶200U。加DEPC水至总体积25L，42cI=60min逆转录，逆转录后产物为cDNA，PCR反应体系为cDNA 2μL，TaqDNA聚合酶0.5U，10×Buffer(Mg2+)5μL，10mmol/L dNTP3 4μL，人sTNFRl引物各25pmol，加双蒸水至总体积50μL.PCR条件：95℃5min预变性，94℃40s变性，55℃40s退火，72℃1min延伸，32个循环后，72℃延伸15 min． 　　1.2.2 构建T载体克隆 　　PCR产物用DNA回收纯化试剂盒回收纯化后与T载体连接，转入感受态大肠杆菌JMl09，经蓝、白筛选，挑选单个阳性克隆，在含有100mg/L氨苄青霉素培养基中过夜生长，提取质粒，用BamH I和EcoR I双酶切鉴定。 　　1.2.3 构建真核表达载体亚克隆