人sTNFR1基因原核表达及体外抗肝细胞凋亡活性研究.docVIP

人sTNFR1基因原核表达及体外抗肝细胞凋亡活性研究 　　彭仕芳　傅　蕾　谭德明　候周华　刘洪波 　　摘要：采用RT-PCR，从Hela细胞的mRNA中扩增人STNFR1基因，构建含有目的片段的T载体克隆及原核表达载体pMAL-c2x重组质粒亚克隆，转化入大肠杆菌，测序证实其序列与基因数据库中STNFRl基因一致，经异丙基，-β-D半乳糖苷酶(IPTG)诱导表达，淀粉树脂亲和层析法纯化，得到融合蛋白STNFR1-MBP，结果显示：经Western-blotting检测，STNFR1-MBP具有免疫活性；流式细胞术检测目的蛋白对TNF-α诱导QSG7701凋亡有抑制作用，这为今后的研究打下了基础。 　　关键词：人STNFRl；原核表达；抗肝细胞调亡 　　中图分类号：R575.3 　　文献标识码：A 　　文章编号：1007-7847(2007)02-0147-06 　　 　　肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factor α，TNFα)是由单核，巨噬细胞分泌的具有多种生物学活性的细胞因子，能诱发肝细胞坏死和凋亡，其过度表达是肝功能衰竭发生发展过程中的一个重要因素，TNFα生物学作用通过特异性受体介导，而TNFα的可溶性受体(STNFR1)可中和TNFα的毒性作用，为有效抑制TNFα所诱发的细胞毒作用以及治疗肝功能衰竭，本研究从克隆STNFR1基因、构建原核表达质粒人手，获得了具有生物学活性的重组蛋白sTNFR1-MBP，为进一步研究该蛋白在肝功能衰竭的作用奠定基础。 　　 　　1材料与方法 　　 　　1.1材料 　　1.1.1细胞株、菌种与质粒 　　QSG7701人非致瘤性肝细胞株由中南大学湘雅医学院病理教研室所赠，JM109由我室保存，pGEM-T载体购自Promega公司，表达载体pMAL-c2x购自NEB公司。 　　1.1.2酶及主要试剂 　　TaqDNA聚合酶、rr4DNA连接酶、Sal I、EcoR I购自TakaRa公司，MMLV逆转录酶和WFG购自Promega公司，DNA凝胶纯化试剂盒购自QIA-GEN公司，淀粉树脂购自NEB公司，麦芽糖购自Sigma公司，Annexin-V-FITC凋亡检测试剂购自生物晶美公司，TNF-a、兔抗人STNFR1多克隆抗体购自PEPROTECH公司，Western blotting检测试剂盒购自博士德公司，TRIzol Reagent RNA分离液、DMEM(高糖)、新生牛血清购自美国GIBCOBRL公司产品，放线菌素-D购自北京夏斯生物公司，常用试剂为国产或进口分析纯。 　　1.1.3仪器 　　核苷酸测序使用ABl377全自动测序仪及配套的BigDye Terminator??剂盒测序，由博亚公司完成；流式细胞仪(FCM)为美国Becton Dickinson公司产品。 　　 　　1.2方法 　　1.2.1 RT-PCR扩增sTNFR1目的片段 　　PCR引物参照人可溶性肿瘤坏死因子受体1(sTNFR1)cDNA全序列设计，由上海博亚公司合成，上下游引物5′分别加入Sa/I和EocR I酶切位点，上游引物：5′－GAA TCC ATG GAT AGTGTG TGT CCC C-3′；下游引物：5′-GTC GAC GGATCC TCA AAT GAT CAG GGG CAA C-3′，按TRI-zol说明书自Hela细胞中提取总RNA作为逆转录模板，采用RT-PCR方法扩增sTNFR1基因，逆转录反应条件参照MMLV逆转酶说明书进行：取总RNA 3μg，oligo(18)0.5μg，加DEPC水至总体积12μL，70℃5 min后，立即置于冰上；然后加入5xRT Buffer 5μL，dNTP 12.5 nmol，RNA酶抑制剂25U，MMLV逆转录酶200 U，加DEPC水至总体积25μL，42℃60 min逆转录，逆转录后产物为cDNA，PCR反应体系为DNA2μL。TaqDNA聚合酶0.5u，10xBuffer(Mg2+)5L，10mmol/L dNTP34μL，人sTNFR1引物各25pmo1，加双蒸水至总体积50μL l.PCR条件：95℃5min预变性，94℃40 s变性，55 qC 40 s退火，72℃lmin延伸，32个循环后，72℃延伸15min， 　　1.2.2构建原核表达质粒 　　PCR产物纯化后，首先应用T载体克隆，然后从重组的“T”质粒DNA中，应用Sal I、EocR I双酶切出sTNFR1基因片段，与用相同酶切后的pMAL-c2x质粒DNA连接重组，转入感受态细菌JM109，挑取阳性克隆，接种于含有100mg／L氨苄青霉素的LB培养过夜生长，提取质粒，Sal I和EocR I双酶切分析，并且