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利用核糖体展示技术筛选功能性蛋白质方法建立 　　摘 要：核糖体展示(ribosome display)是一种体外筛选功能性蛋白质的有力的工具。利用体外转录和翻译偶联系统可以方便而快捷地完成核糖体展示。筛选系统利用一对能够紧密结合的蛋白质：人锚蛋白(ankyrin)和红血球膜带3蛋白细胞质区域(cytoplasmic domain of erythrocyte membrane protein Band 3，Cdb3)作为模式分子，希望利用cdb3蛋白通过核糖体展示亲和选择得到锚蛋白基因．用于核糖体展示的人锚蛋白基因结构由组装PCR构建，通过PCR技术引入核糖体展示所需的结构元件。在亲和筛选步骤后，只能利用红血球膜带3蛋白筛选得到锚蛋白基因，而不能利用对照牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)筛选得到，从而说明建立的核糖体展示技术能够正常发挥作用。 　　关键词：核糖体展示；体外筛选；功能性蛋白；锚蛋白；红血球膜带3蛋白 　　中图分类号：Q781 　　文献标识码：A 　　文??编号：1007―7847(2006)01―0028―06 　　核糖体展示是一种体外筛选功能性蛋白质的 有力的工具。首先，Mattheakis等人建立了一种用 于能够展示和筛选肽的体外系统，随后由Hanes 和Pluckthun等人正式建立了这种功能性蛋白体 外筛选技术。迄今为止，这一技术已经被成功地 应用于体外筛选与靶分子有亲和能力的功能性分 子的相关领域。与其他的体内蛋白质筛选系统 不同的是，核糖体展示库的建立不需要细菌转化步 骤，其展示库的多样性能够得到充分保留。 　　在特定的反应条件下，蛋白质基因型和表型 可以通过mRNA-核糖体-蛋白质三联体复合物 的形式联系起来．构建的核糖体展示DNA库中， 可能包含有编码靶蛋白例如功能性蛋白的DNA 分子。DNA库在体外进行转录，转录后的mRNA 纯化后可用于体外翻译，由于构建的mRNA分 子缺乏终止子，核糖体会与mRNA的末端保持结 合状态从而形成mRNA-核糖体，蛋白质三联复 合物，在高浓度镁离子和低温条件下该复合物非 常稳定。通过亲和结合作用，利用固定在固相或 溶液中的配体，能够筛选出与其具有结合能力的 复合物。加入EDTA后，可以将结合下来的复合 物的mRNA洗脱下来．洗脱下来的mRNA经过 纯化可以用作RT-PCR从而恢复其基因型。逆 转录PCR产物也可以用于下一轮核糖体展示。 整个核糖体展示过程参照图1。 　　红血球膜带3蛋白占人红细胞膜蛋白质的 25％，是丰度最高的蛋白质，它主要包括两个结 构域：跨膜区域和细胞质区域。红血球膜带3蛋 白的细胞质区域是膜相关蛋白的锚定位点。锚蛋 白就是其中一种能够与膜带3蛋白紧密相连的外 周蛋白。我们利用这一对能够紧密结合的蛋白 质分子以验证核糖体展示技术的正确建立。 　　在核糖体展示技术中，体外转录和翻译通常 是分开进行的，在我们的这篇报道中利用体外转 录翻译偶联系统，使DNA库的体外转录和翻译同 时进行，从而更加方便和快捷地完成核糖体展示 技术。 　　 　　1 材料和方法 　　 　　1，1 构建用于核糖体展示的锚蛋白基因 　　用于核糖体展示的锚蛋白的构建由组装PCR 完成。其DNA分子模板包括一个T7启动子，转 录后的RNA分子包括一个5＇―和3＇－的茎环结 构，一个原核核糖体结合位点，Flag-tag标记的锚 蛋白基因不含终止密码子，其C末端含有一段作 为间隔子的基因序列(图2A)。 　　在第一步中，用引物1和引物2从周建忠博 上馈赠的含有cdb3的pGEX-2T质粒中扩增锚蛋 白基因。在第二步中，利用引物3和引物4从 AndreasPlOckthun教授馈赠的PAK200质粒中扩 噌噬菌体M13的羧基端作间隔子，其作用是确保 新合成的蛋白质与核糖体相连，并且能够利用间 隔子隔出合适的空间以让新合成的蛋白质正确折 叠。将前两次的PCR产物纯化以等摩尔的比例 混合，使用引物4和引物5做连接PCB，将锚蛋白 基因和间隔子连接起来，在最后一步中，将上一 步的PCR产物用引物6和引物4进行扩增，引入 T7启动子和5’-茎环结构。扩增步骤和引物序列 见图2B。 　　 　　1．2 将配体固定在微孔板的表面 　　400 ng的edb3溶于100μL的PBS中4℃ 过夜包被微孔板。包被的微孔板用PBS洗3次， 再用含5％(w／v)BSA和50 mg／LS.cerevisiae RNA(Sigma)的PBS封闭。另外，用含5％(w／v) BSA和50mg／LS．cerevisiaeRNA(Sigma)的PBS 封闭空白孔用作对照．微孔板用PBS洗5次，用 washing buffer WBT(50 mmol／L Tr