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受精卵反义寡核苷酸显微注射影响因素研究 　　摘 要：以金鱼受精卵为材料，通过胚胎培养探讨反义寡核苷酸显微注射剂量、受精卵质量、胰酶消化浓度等对受精卵反义寡核苷酸显微注射的影响，研究表明，反义寡核苷酸注射剂量在4.6nL、胰酶消化浓度在0.4％的情况下，选用质量较好的受精卵注射，显微注射效果较好，可为之后的基因功能研究提供材料保障，利用显微注射法导入反义寡核苷酸来研究基因的功能，是研究基因功能的有效途径。 　　关键词：金鱼；反义寡核苷酸技术；显微注射；胚胎培养 　　中图分类号：0954.4　文献标识码A　文章编号：1007-7847(2007)04-0234-04 　　 　　反义寡核苷酸技术(Antisense olizonuclcoti-des，ASON)是用一段人工合成的能与RNA或DNA互补结合的寡核苷酸链抑制基因的表达，其原理通过阻抑从DNA至mRNA的转录过程或从mRNA到蛋白质的翻译过程，而阻断细胞中的蛋白质合成，反义寡核苷酸技术具有高特异性、无毒性等特有的优点，近年来在抗病毒、抗肿瘤、细胞凋亡、信号传导及在遗传育种、胚胎发育的研究中有愈来愈广泛的应用，将反义核酸导人体内是反义核酸技术中的重要环节，目前主要方法有：直接微注射、血管壁外聚合药物转运系统、气囊导管定位腔内转移、改良电穿孔法等，因金鱼体外受精体外发育，且个体产卵数量大，胚胎透明，用显微注射法将反义寡核苷酸(ATc，SCON)直接注入受精卵，可在活体上观察金鱼器官发育，因此该研究方法在研究鱼类胚胎发育调控机制有突出的优越性，本实验室在前期研究工作中发现，Vsxl基因是与金鱼眼睛空间模式形成相关的调控基因和分析二倍体依赖型机制的候选目标基因，为了研究候选目标基因Vsxl在金鱼发育过程的具体功能及对其下游基因的调控机制，我们采用反义寡核苷酸技术和显微注射的方法，将反义寡核苷酸(ATG，SCON)直接注入金鱼的受精卵，使Vsxl的mRNA不能翻译成相应的蛋白质，以此探究Vsxl在金鱼胚胎发育过程中的功能及其调控方式，显微注射反义寡核苷酸是该项研究的前提条件，本文探讨了影响金鱼受精卵反义寡核苷酸显微注射的客观因素，为提高反义寡核苷酸显微注射成功率提供依据。 　　 　　1　材料与方法 ??　 　　1．1　材料 　　1．1．1　试剂 　　注射用硫酸链霉素(100万单位)，注射用青霉素钠(80万单位)均为华北制药股份有限公司产品；氯化钠、氯化钙、氯化钾、碳酸氢钠、胰蛋白酶等为国产分析纯试剂；优质石蜡油；灭菌ddH2O；过滤了的曝气水；过滤了的加了抗生素的隔夜冷开水。 　　配制5倍浓度的Half’s液(即高渗液)，10倍浓度的Haft’s液；10倍浓度的Half’s液配方：35g NaCI，1g CaCl2，0.5g KCl溶于1L ddH2O中，烧开后冷却通气，临用前加NaHCO，配成0.2g/L；将青霉素80万单位溶于2mL ddH2O中，取25uL溶解好的青霉素至1L Half’s中，将链霉素100万单位溶于2.5mL ddH20中，取125μL溶解好的链霉素至1L Half’s中。 　　1．1．2　仪器设备 　　XTB-01型体视镜购自中国光学仪器厂；NANOLl7ER2000显微注射系统购自美国WPI公司；注射用的毛细管为WPI公司的Replacement3.5 inch glass capillary(300)；拉针仪为美国Sutter公司生产的P97 Puller；Pr0600ES型显微照相图象采集系统购自日本Nikon公司；Viewfinder3.0成像软件购自日本Olympus公司。 　　 　　1．1．3　注射用反义寡核苷酸 　　显微注射用反义寡核苷酸morpholino oligosATG，SCON为Gene Tools公司合成，ATG为与金鱼Vsxl基因的mRNA序列中1～24碱基序列互补的一段序列；SCON为standard control即标准对照，为一段人类特有的还未发现与之互补的一段序列，注射前将300mmol/L的morpholinooligos溶于300μL灭菌水配成浓度为1nmol/lmorpholino oligos，分装保存于-70℃冰箱中备用。 　　1．1．4　实验动物 　　“红帽子”品系金鱼幼苗(Carassius auratus)购自长沙市花鸟市场，于金鱼饲养场饲养至成熟。 　　 　　1．2　实验方法 　　1．2．1　受精卵的制备 　　将红帽雄性金鱼的精液挤入装有少量曝气水的培养皿中，同时挤入同品系的雌性金鱼卵子，使之受精，得到自交二倍体受精卵，每次控制受精卵数目约200个。 　　1．2．2　金鱼受精卵的显微注射 　　1．2．2．1　受精卵去膜 　　受精卵受精后静置3～5mi