人类基因组(上).pptVIP

人类基因组计划(HGP) 美国政府决定于 1990年正式启动HGP，预计用 15 年时间，投入 30 亿美元，完成 HGP。 能源部和国立卫生研究院共同组成“人类基因组研究所” 逐渐地，HGP 扩展为多国协作计划。参与者包括：英、日、法、德和中国（1993年） 二000年六月二十六日克林顿宣布 人类基因组草图绘制完成 美国国家人类基因组研究所所长弗朗西斯·柯林斯在介绍情况 人类基因组计划的中国发起者 中国参与完成人类基因组计划的1% 原有基因组测序流程 克隆DNA片段 采用不同实验方法引入不同长度末端标记的片段 通过介质分离 荧光信号读数 分析峰图 单个反应可测 500 到1,000 bp ABI3730 xl一次测序理论最大值96,000 bp 序列拼接 基于Sanger法的基因组鸟枪法测序 第一，建立高度随机、插入片段大小为2kb左右的基因组文库。 第二，高效、大规模的末端测序。 第三，序列集合。 第四，填补缺口。 第一代测序技术的应用 第一个被测序的生物体为φX174噬菌体（5386bp，Sanger,1977） 1982年完成λ噬菌体，而后巨细胞病毒（229kb ）、痘苗病毒（192kb ）、地钱 （Marchantia polymorpha）的线粒体（187kb）和叶绿体（121kb）…….. 人类基因组计划是历史性的事件 人类基因组草图基本信息 由31.65亿bp组成 含2~3万基因 与蛋白质合成有关 的基因占2% 第二代测序技术流程 获取DNA 将其与一些接头或基质连接 用荧光标记试剂延伸并扩增 检测荧光信号. 将一系列点信号转换为DNA序列 每个序列长度在30-300bp 测序量空前提高，0.4 to 1.2 GB/轮 (1,200,000,000 bp/天). 片段较长的可以进行拼接，而短的则在基因组上重贴 Roche / 454 454 测序简要原理 大规模的并行测序, “边合成边测序”: 每次反应都依次加入ATGC四种核酸，从而产生焦磷酸 焦磷酸在硫酸化酶作用下生成ATP,荧光素酶则利用其作为能量单位作用底物激发荧光 三磷酸腺苷双磷酸酶将每步剩余的dNTP降解 荧光信号被检测并转换为序列信息 454 测序流程 文库制备：基因组DNA/cDNA片段化处理至400-800bp间，生物素修饰及加接头 Emulsion PCR：特定比例的单链DNA文库被固定在特别设计的DNA捕获磁珠上，使大部分磁珠磁珠携带了一个独特的单链DNA片断。磁珠结合的文库被扩增试剂乳化，形成油包水的混合物，每个独特的片断在自己的微反应器里进行独立的扩增，而不受其他的竞争性或者污染性序列的影响。整个片段文库的扩增平行进行。 454 测序流程 测序反应： 扩增产物被回收纯化。携带DNA的珠子与其他反应物混合物，随后放入PTP板中进行后继的测序。PTP孔的直径（29um）只能容纳一个珠子（20um）。然后将PTP板放置在GS FLX中，焦磷酸测序。每一个与模板链互补的核苷酸的添加都会产生化学发光的信号，并被CCD照相机所捕获 数据分析： GS FLX系统一个循环可获得100多万个读长，读取超过4-6亿个碱基信息，通过GS FLX系统提供的信息工具Newbler对测序数据进行分析 Solexa –Illumina Genome Analyzer Solexa基因组测序简要流程 文库制备 样品收集，基因组DNA打断，DNA 末端修复，连接接头 DNA片段在Cluster Station上成簇扩增 准备Flowcell和试剂，安装到Cluster Station；将样品DNA连接到Flowcell；完全自动化完成Cluster制备 基于DNA簇的边合成边测序 Flowcell和试剂，安置到Genome Analyzer；全自动化完成测序，包括测序长Reads；图片处理，碱基识别； 数据分析 采用软件进行基因组重贴（gnumap、ELAND）或拼接（ABySS、MIRA2） Solexa特点 测序通量高：每个测序反应能达到20G左右的数据通量，2009年推出了双端读数的升级装置（Paired-end），进一步提高通量 准确率高： 同时也有效地解决了多聚重复序列的读取问题 读长短（单向150bp），无法有效拼接 适合基因组重测序与表达谱测序 技术不断提升：目前读长已达100-150bp，且总数据量迈向200G(Genome Analyzer IIx ) ABI SOLiD SOLiD测序流程 文库制备：随机片段文库；末端配对文库 模板磁珠制备：油包水微型反应体系；DNA片段在磁珠上扩增 磁珠固定：磁珠随机固定在测序玻片表面；每个测序玻片上的