第二章——色谱新技术xue.pptVIP

6、新进展 1）微型化 整体化学分析系统（TAS）及TAS微型化 在硅片上光刻出矩形槽作为毛细管，理论塔板数105/m； 2）联用仪器 CE-MS； 3）阵列毛细管凝胶电泳 应用于人类基因DNA测序； * * * * * * 4. 温度的影响 毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。温度变化来自于“焦耳热”； 焦耳热：毛细管溶液中有电流通过时，产生的热量； HPCE中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导、浓度及电场强度成正比。 温度每变化1度，将引起背景电解质溶液黏度变化2%～3%； 5. 添加剂的影响 （1）加入浓度较大的中性盐，如K2SO4，溶液离子强度增大，使溶液的黏度增大，电渗流减小。 （2）加入表面活性剂，可改变电渗流的大小和方向； 加入不同阳离子表面活性剂来控制电渗流。 加入阴离子表面活性剂，如十二烷基硫酸钠（SDS），可以使壁表面负电荷增加，zeta电势增大，电渗流增大； （3）加入有机溶剂如甲醇、乙腈，使电渗流增大。 四、淌度 mobility 淌度：带电离子在单位电场下的迁移速度； 淌度不同是电泳分离的基础。 1.绝对淌度(absolute mobility)μab 无限稀释溶液中带电离子在单位电场强度下的平均迁移速度，简称淌度。可在手册中查阅。 2.有效淌度(effective mobility)μef 实际溶液中的淌度(实验中测定的)。 μef=∑aiμi ai -溶质i 的解离度;μi -溶质i 在解离状态下的绝对淌度 3.表观淌度 μap 离子在实际分离过程中的迁移速度（表观迁移速度）： νap=μap ? E 五、HPCE中的参数与关系式 1.迁移时间（保留时间） HPCE兼具有电化学的特性和色谱分析的特性。有关色谱理论也适用。 V—外加电压；L—毛细管总长度； 2.分离效率（塔板数） 在HPCE中，仅存在纵向扩散，σ2=2Dt 扩散系数小的溶质比扩散系数大的分离效率高，分离生物大分子的依据。 = N ; 2 2 = D EL DL VL ef ap ef ap m m Lef σ = ( ) 2 N = 5.54(tR/Y1/2)2 3.分离度 影响分离度的主要因素；工作电压V；毛细管有效长度与总长度比；有效淌度差。分离度可按谱图直接由下式计算： 六、影响分离效率的因素—区带展宽 1.纵向扩散的影响 在HPCE中，纵向扩散引起的峰展宽：σ2=2Dt 由扩散系数和迁移时间决定。大分子的扩散系数小，可获得更高的分离效率，大分子生物试样分离的依据。 2.进样的影响 当进样塞长度太大时，引起的峰展宽大于纵向扩散。分离效率明显下降；理想情况下，进样塞长度： Winj= (24D t )1/2 实际操作时进样塞长度小于或等于毛细管总长度的1%～2%。 3.焦耳热与温度梯度的影响 电泳过程产生的焦耳热可由下式计算： ?m—电解质溶液的摩尔电导；I—工作电流：cb—电解质浓度； 散热过程中，在毛细管内形成温度梯度（中心温度高），破坏了塞流，导致区带展宽。 改善方法： （1）减小毛细管内径； （2）控制散热； 4.溶质与管壁间的相互作用 存在吸附与疏水作用，造成谱带展宽； 蛋白质、多肽带电荷数多，有较多的疏水基，吸附问题特别严重，是目前分离分析该类物质的一大难题。 细内径毛细管柱，一方面有利于散热，另一方面比表面积大，又增加了溶质吸附的机会。 减小吸附的方法和途径：加入两性离子代替强电解质，两性离子一端带正电，另一端带负电，带正电一端与管壁负电中心作用，浓度约为溶质的100-1000倍时，抑制对蛋白质吸附，又不增加溶液电导，对电渗流影响不大。 5.其他影响因素 （1）电分散作用对谱带展宽的影响 当溶质区带与缓冲溶液区带的电导不同时，也造成谱带展宽；尽量选择与试样淌度相匹配的背景电解质溶液。 （2）“层流”现象对谱带展宽的影响 一般情况下，HPCE中不存在层流，但当毛细管两端存在压力差时，出现抛物线形的层流； 产生的原因：毛细管两端液面高度不同。 实际操作时，保持毛细管两端缓冲溶液平面高度相同。 1、仪器流程与主要部件 电压：0～30kV； 分离柱不涂敷任何固定液； 紫外或激光诱导荧光检测器； （可检测到：10-19～10-21 mol/L） 七、高效毛细管电泳仪 1）高压电源 （1）0～30 kV 稳定、连续可调的直流电源； （2）具有恒压、恒流、恒功率输出； （3）电场强度程序控制系统； （