葫芦砧木种子中带菌量与砧木苗期细菌性果斑病发生的关系.docVIP

葫芦砧木种子中带菌量与砧木苗期细菌性果斑病发生的关系 　　细菌性果斑病(bacterial fruit blotch,BFB)是多种瓜类作物的重要病害,病害主要侵染源为种子带菌。在中国,BFB是一种检疫性病害,其病原菌为燕麦嗜酸菌西瓜亚种(Acidovorax avenae ssp.citrulli,Aac),属革兰氏阴性菌。 　　Aac可在植株的叶片、茎部和果实等部位引起病害,尤其以苗期及果实期危害最严重。苗期发病可导致整株幼苗死亡,而在果实上发病则造成减产,甚至绝收。该病害在高温高湿的环境下发病十分迅速,迄今为止在世界范围内还没有完全免疫BFB的葫芦科作物品种。BFB在中国新疆、内蒙古、海南、湖北、河南等许多地区均有发生,并给瓜类生产造成极大的经济损失。 　　近几年来,随着育苗工厂集约化的迅速发展,西甜瓜嫁接苗技术已广泛运用于大型的育苗工厂中。 　　该技术在防治西甜瓜枯萎病等多种土传病害上具有很好的效果,但育苗工厂中育苗的密集性和适宜Aac存活与生长的高温高湿环境,也为细菌性果斑病在嫁接育苗过程中的存活和大规模爆发提供了有利条件。目前,对工厂化育苗中细菌性果斑病苗期的侵染途径研究较少。笔者分析了葫芦砧木种子中不同Aac带菌量与砧木苗期细菌性果斑病发生的关系,旨在明确细菌性果斑病通过种子带菌引起苗期发病的侵染途径,为嫁接苗工厂化育苗生产和有效防治细菌性果斑病提供理论依据。 　　1、材料与方法 　　1.1试验材料 　　供试砧木葫芦种子品种为京欣砧1号,由北京京研益农科技发展中心提供;燕麦嗜酸菌西瓜亚种(Aac)菌株Pslb96由中国农业科学院植物保护研究所赵廷昌研究员惠赠。试验固体培养基为KBA培养基(蛋白胨20g、硫酸镁1.5g、磷酸氢二钾1.5g、甘油10g、蒸馏水1 000mL、琼脂20g、pH 7.0~7.4),液体培养基为KB(无琼脂KBA培养基)。育苗基质为有机营养土,由镇江培蕾基质科技发展公司生产。 　　1.2 Aac菌液配制参考Dutta等的方法配制Aac不同浓度菌液。将Pslb96株划线接种在KBA平板上,置于28培养箱内,培养2d后挑取单菌落,接种在KB培养液中,在30下摇培(250r/min)过夜。将菌液于6 000r/min离心5min。弃上清后,菌体用0.1×PBS缓冲液重新悬浮。用分光光度计测定菌悬液的吸光值(D600),并用PBS缓冲液将菌悬液的D600值调节至0.3(菌体浓度约为1×108cfu/mL。 　　最后用0.1 × PBS缓冲液将菌悬液的浓度分别调节至1×103、1×105、1×107cfu/mL。 　　1.3 Aac接种与病害调查参考王晓东的方法用不同浓度的菌悬液处理葫芦砧木种子。 砧木种子用5% NaClO消 毒5min,随后用无菌水中浸洗3次,并将其浸泡在各浓度Aac菌悬液中1h。以浸泡在无菌水中的种子作为对照,各处理48粒种子。最后将清洗后的种子在室温 下晾干过夜,在30恒温培养箱中催芽72h,将葫芦砧木种子播种在穴盘内的基质中,每穴1粒种子。将穴盘置于日温为28~32,夜温为20~22的温室中(无补光措施)进行育苗。分别在接种后4、6、8、10、12d逐株检查幼苗发病情况,统计发病率与病情指数。病害等级分级标准参考金岩的方法并略加修改,即按照病斑面积占总子叶面积百分比进行分级:0级,不发病;1、2、3、4、5级,病斑面积分别为60%。各处理重复3次。 　　1.4 Aac侵染观察与病菌分离用浓度为1×107cfu/mL的Pslb96菌液浸泡葫芦砧木种子1h,并将种子播种在穴盘中,在温室播种后连续观察幼苗的发病情况和发病部位,再分别在播种4、6、8、10d后取子叶下胚轴0~3cm和3~6cm处进行Aac的分离。将幼苗的不同部位在5%的NaClO溶液中表面消毒3min,用无菌水冲洗3次后,将病组织浸入无菌水中并捣碎,静置20min使组织中病菌释放入水中。然后将组织悬液进行梯度稀释,涂布于含有氨苄青霉素(1mg/mL)和黄连素 (20mg/mL)的选择性培养基上,28下培养48h。统计类似Aac菌落数量。为验证分离的细菌是Aac,在平板上挑取疑似Aac单菌落5个,接种在含氨苄青霉素(1mg/mL)和黄连素(20mg/mL)的KB培养基中摇培过夜,菌液用Aac特异性引 物WFB1和WFB2进行PCR扩增以确定目标菌是否为Aac。 　　1.5 Aac在葫芦幼苗中定殖的观察。取下胚轴有明显细菌性果斑病病症的砧木幼苗,将其下胚轴发病部位剪下,并进行FAA固定,梯度乙醇脱水,石蜡渗透包埋、切片、去蜡、蕃红固绿染色、二甲苯透明、香脂封固,最后制成石蜡切片。石蜡切片的操作参考方中达的方法。制成的石蜡切片在微分干涉显微镜下进行观察,明确样品中Aac在砧木下胚轴中的定殖部位。 　　2、结果与分析