研修班-基因分析-20131124课件.pptVIP

两端都加上测序接头 P5 尿嘧啶的特异性的切割位点 P7糖基化酶的切割位点 从测序的地方开始说，对P5引物的尿嘧啶线性化切割位点进行切割，将线性化的链洗掉。 将新合成的100bp的链进行变性洗脱，然后 * 待测模板结合到带有P1引物的磁珠上，乳液pcr的扩增过程，基于DNA连接酶，不是通常我们用的DNA聚合酶 * 片段，配对末端 * * 磁珠、待测模板、PCR反应元件 * * 乳液PCR反应放在数目巨大的独立反应空间内，开始是一个注水倒油的过程。在PCR反应之前，将反映容易注入到高速旋转地矿物油表面。 * * 经过多次扩增后，。。 * * 甘油的梯度密度离心 二代测序技术 - ABI SOLiD – step5 连接测序 二代测序技术 - ABI SOLiD 四、蛋白质的分析方法 蛋白质的定量分析： ELISA(Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent-Assay) Western blot 蛋白质的定位： 免疫组织化学 荧光蛋白的活细胞定位 蛋白质相互作用的研究 蛋白质功能的研究 蛋白质组学技术 Proteomics 蛋白质组与蛋白质组学： 对特定组织细胞总蛋白的整体性研究 蛋白质组学研究的目的什么？ 解读基因组：基因组编码了多少基因？ 蛋白表达：比研究 RNA 表达深入了一步 蛋白功能：超过 1/3 的蛋白质功能不明确 蛋白质修饰：糖基化、磷酸化、酶解等 蛋白质定位：subproteome 蛋白-蛋白相互作用：互作是功能的基础 (1) 蛋白质组学的核心技术是什么？ 1975 年，双向电泳技术建立 1990 年，更新的 Edman 降解法用于微量蛋白质测序，灵敏度达到 pmol 级 质谱技术使蛋白测序灵敏度达到 fmol 级 基因组计划提供了大量的生物信息 双向电泳＋质谱＋生物信息分析 双向电泳 等电聚焦＋SDS双向电泳的优点与缺陷 优点： 比单向电泳有更高的分辨率 缺点与解决办法： 无法检测低丰度蛋白：分组检测 无法检测大分子量或脂溶性蛋白：酶解 电泳图谱解读困难：自动化分析、DIGE Difference gel electrophoresis (DIGE) Mass spectrometry 肽质谱(MS)：分析混合多肽 只能确定氨基酸组成，不能分析序列 氨基酸质谱：分析单一肽的氨基酸序列 串联质谱(Tandem mass spectrometry，MS/MS) 可以分析氨基酸序列 通过与数据库比较确认肽的来源 MS 与 MS/MS MS/MS (2) 如何进行蛋白-蛋白相互作用的分析？ 酵母双杂交(yeast two-hybridization) 噬菌体展示文库(phage display library) 免疫共沉淀(co-immunoprecipitation) 荧光共振能量传递FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer) Yeast two-hybridization 酵母双杂交：蛋白质相互作用的筛查方法 以特定蛋白为钓饵，筛选其相互作用蛋白 Phage display library 蛋白质相互作用的筛查方法 免疫共沉淀 特定蛋白对相互作用的分析方法 FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer荧光共振能量传递 蛋白相互作用的活细胞分析方法 (3) 如何利用蛋白质组学方法进行功能分析？ 蛋白质芯片 抗原－抗体 鉴定蛋白质相互作用 鉴定蛋白质与小分子相互作用：代谢组学 检测酶活性：蛋白质功能的高通量分析 本章的主要内容是什么？ 通过本章学习了解了哪些核酸和蛋白质分析方法？ 什么是分子杂交？ 分子杂交的探针是什么？如何进行标记？ 分子杂交有哪些基本方式？ 什么是 PCR？基本原理是什么？ PCR 反应体系是由什么组成的？ 本章的主要内容是什么？ 什么是 RT-PCR？能用来干什么？ 如何利用 PCR 进行核酸的定量分析？ 什么是基因芯片？ 什么是蛋白质组学？核心方法是什么？ 如何进行蛋白质相互作用的研究？ 谢 谢！ * * 大家知道生物体内的基因组DNA包含着几乎全部的生物遗传信息，因此要想透彻了解生物体的整个生命过程的本质，我们必须获得该生物体的整个DNA序列信息，因此测序技术的进步从某种意义上来说，决定了整个生物学研究的水平和深度。 测序技术可以追溯的20世纪的50年代，早在1954 化学降解方法，操作复杂，并没有被广泛使用。 1977 双脱氧核苷酸末端终止法，一直在使用 1977 化学降解方法，原理同sanger，加入某种化学试剂，对DNTP的5‘端的磷酸基团进行标记，化学修饰，裂解DNA片段，形成一系列大小不一的小分子DNA片段，电泳 80年代中期，荧光标记，代替同位素标记