农杆菌介导的烟草高效遗传转化体系的建立.doc

农杆菌介导的烟草高效遗传转化体系的建立 江苏农业科学2011年第39卷第3期一67一 赵莉,钟鸣,马慧,等.农杆菌介导的烟草高效遗传转化体系的建立[J].江苏农业科学,2011,39(3):67—68,74 农杆菌介导的烟草高效遗传转化体系的建立 赵莉,钟鸣,马慧,李浩戈,陈丽静,钟声 (沈阳农业大学/辽宁省农业生物技术重点实验室,辽宁沈阳110161) 摘要:利用农杆菌介导的叶盘转化法获得遗传转基因植物,这是研究目的基因功能的一种有效方法.通过对浸 染时间,共培养时间,不同浓度头孢霉素,卡那霉素对农杆菌的抑菌效果及其对烟草叶片分化的影响等进行探索,建立 了一种稳定高效的烟草遗传转化体系. 关键词:烟草;根癌农杆菌;浸染;遗传转化 中图分类号:$572.032文献标志码:A文章编号:1002—1302(2011)03—0067—02 由于烟草的组织培养简单,基因转化效率较高等优点,烟 草成为植物基因工程和分子生物学研究中重要的模式植 物..自从Horsh等首次获得烟草转基因植株以来,以 烟草为材料的转基因技术为基因功能分析提供了有效途径, 同时使植物遗传转化的研究和应用得到飞速发展.在植物基 因工程中,目前研究最清楚,应用最广泛的外源基因转化方法 是根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导的遗传转化技 术,在已获得的近200种转基因植物中约有80%是由农杆菌 介导完成的.因方法简单,效率高,拷贝数少等优点,它已 成为目前主要的转基因技术.建立快速,高效,简便的植 株遗传转化体系对快速获得转基因植株至关重要.其中, 外植体的选择及其特定的生理状态,抗生素的筛选,农杆菌浸 染浓度,浸染时间,外植体的暗培养时间等是植株遗传转化体 系中的关键因素.本研究以普通烟草品种中烟100为外 植体,通过农杆菌介导的叶圆盘法对烟草进行遗传转化,探索 农杆菌介导的遗传转化条件及其影响因素,建立农杆菌介导 的烟草高效遗传转化体系,为目的基因功能的研究提供较好 的基础. 1材料与方法 1.1试验材料 1.1.1植物材料以烟草品种中烟100为试验材料,种子浸 于体积分数75%乙醇中30s,用无菌水冲洗,然后浸于0.1% 氯化汞中4rain,滤出种子,再以无菌水清洗3—5次,用滤纸 吸干.将消过毒的种子接种于播种培养基(1/2MS)中,于26 ℃光照条件下培养,得到烟草无菌苗叶片. 1.1.2菌株和质粒转化受体菌为根癌农杆菌EHA105,载 体为pBI121,含卡那霉素筛选抗性基因以及目的基因,利用 液氮直接转化法将质粒转入农杆菌中. 收稿日期:201l一01一l4 基金项目:国家自然科学基金(编号31070448);辽宁省农 业生物技术重点实验室专项基金. 作者简介:赵莉(1985一),女,河南鹤壁人,硕士研究生,主要从事 细胞分子生物学方面的研究.E—mail:zhaozhao336@163.com. 通信作者:钟鸣,博士,副教授,主要从事植物生物技术的研究. E—mail:mingzhl@sina.tom. 1.2试验方法 1.2.1头孢霉素对农杆菌的抑制作用将共培养后的外植 体用无菌水冲洗4～5次,用滤纸吸干表面水分,再分别转到 附加不同质量浓度(100,200,300,400,500,600mg/L)的头孢 筛选分化培养基上进行培养.每处理30个外植体,3组重 复.统计外植体污染率和抗性芽分化率,从而确定最合适的 抗生素浓度. 1.2.2外植体的选择选取30,50,80,120d的烟草叶片, 避开边缘及主脉用打孑L器打成圆盘状,再分别浸入农杆菌菌 液中进行浸染,同时设置未浸染叶片为对照. 1.2.3烟草品种耐卡那霉素水平的敏感性测定将无菌烟 草叶盘分别接种到含卡那霉素0,20,40,60,8O,100mg/L的 MS培养基上,每处理接种3O个外植体,3组重复,培养3—4 周后统计外植体出芽率,从而确定卡那霉素的筛选浓度. 1.2.4农杆菌菌液浸染时间的确定将烟草叶盘分4组,每 组30个外植体,设3组重复.置于活化的农杆菌(D为 0.6)悬浮液中浸泡,间歇摇动,使叶片与菌液充分接触,4组 浸染时间分别为3,6,9,12min.浸染完毕后取出叶盘,用无 菌滤纸吸干表面菌液,转入MS分化培养基中,暗培养2d, 再转入MS培养基中进行筛选培养. 1.2.5农杆菌和外植体共培养时问的确定将侵入后的烟 草叶盘转入MS分化培养基中,分别暗培养1,2,3,4d,然后 转入MS培养基中进行筛选培养.每处理30个外植体,3组 重复.统计外植体抗性芽分化率,从而确定共培养时间. 1.2.6转基因植株PCR和RT—PCR鉴定 (1)PCR检测.采用CTAB法提取MS培养基中生 根的转基因植株和野生型烟草植株幼嫩叶片DNA.以