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　　DNA探针在原位杂交技术的使用技巧分析 【摘要】小编为您整理了DNA探针在原位杂交技术的使用技巧分析，站内容每天更新，欢迎大家时时关注哦! 虽然早在20世纪60年代末70年代初原位杂交技术就已经诞生毕业论文，但是当时采用的是放射性的DNA探针，存在人身安全及探针处理等问题。直至原位杂交技术开始使用荧光标记DNA探针，这才开启了荧光原位杂交(fluorescence in situ hybri-dization，FISH)的时代。荧光原位杂交技术是一种应用荧光物质依靠核酸探针杂交原理在核中或染色体上显示DNA序列位置的方法。与传统的放射性标记原位杂交相比，FISH具有安全、快速、经济、灵敏度高、检测信号强、杂交特异性高、能同时显示多种颜色等优点，因此自该技术问世以来，发展迅速，并广泛应用于分子生物学、医学、细胞遗传学等许多领域。 1 FISH技术的原理及操作步骤FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸作探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因定位在染色体上，可以对待测核酸定性、定位或相对定量分析。FISH的基本操作步骤包括染色体制备、探针标记、将探针与实验材料靶序列杂交以及检测杂交结果。 (1)染色体制备。原位杂交的效率取决于探针与染色体的靠近程度，因此获得背景清晰、染色体分散、形态较好的中期分裂相是FISH中很关键的一步。 (2)探针的制备。常用的探针包括三类，第一类是染色体特异重复序列探针，包括alpha;卫星和卫星Ⅲ类探针等，杂交靶位常大于1Mbp，不含散在重复序列、与靶位结合紧密、杂交信号强、易于检测，常用于检测间期细胞非整倍体和微小标志染色体;第二类是全染色体或染色体区域特异性探针，这类探针由一条染色体或染色体上某一区域几个不同核酸片段组成，可由克隆到噬菌体和质粒上的染色体特异性大片段通过构建文库制备，由于所得探针片段较小，故杂交时与邻近区域发生重叠及制片过程中被破坏的可能性较小，常用于中期染色体重组和间期核结构分析;第三类是位点特异性探针，这类探针由一个或几个克隆序列组成，可由cDNA克隆或克隆到大片段插入载体的核酸片段制备。主要用于染色体DNA克隆序列的定位和靶DNA序列拷贝数及结构变化的检测[12,]。探针用特定分子标记，酶解为200-400bp，这样能增强特异性杂交，同时又减少本底荧光。探针的的荧光素标记分为直接标记法和间接标记法。直接标记法是用荧光染料直接标记核苷酸，常用荧光染料有异硫氰酸荧光素及罗丹明等。间接标记法是先在DNA探针上连接一种半抗原，然后通过能与半抗原特异结合的标记蛋白对目标核酸分子进行检测。最常用半抗原是生物素和地高辛酸基等。探针的标记方法采用缺口平移法、PCR扩增法、随机引物标记法、RNA体外转录法等。探针标记通常有两个目的：一方面将标记好的核苷酸加入到探针序列中去，另一方面可以将DNA片段长度缩小到500 bp以下。 (3)原位分子杂交。最佳杂交条件取决于探针和目标的性质。在含有甲酰胺(DNA变性剂)、硫酸葡聚糖(一种高分子惰性聚合物)和盐的杂交液中混合标记的探针(200～500 bp)。变性后，将探针混合液置于玻片上，如果检测染色体特异重复序列，37℃温育15min;而对于单序列大的插入探针，探针混合物先和未标记的基因组或者Cot I重复序列预杂交1h(探针中非特异的重复序列被封闭，抑制重复序列结合靶DNA)，然后与探针37℃杂交过夜。 (4)荧光标记。错配或未杂交的探针经过洗脱后,把玻片与免疫荧光试剂共同温育,在探针杂交的位置形成荧光。常用的荧光标记物为荧光素异硫氰酸盐(FITC)、罗丹明、德克萨斯(Texas)红等，其它光谱从蓝色到红色的荧光物质都可用于多种颜色分析。检测常用于标记的荧光分子及其特征如表1。 (5)检测分析。将杂交好的片子置于荧光显微镜下，选择合适的滤光片观察并照相,也可用共焦激光扫描记入计算机。荧光镜检时显微镜的质量及滤片的选择，是获得满意结果的重要影响因素，尤其是滤片系统，应严格按照表1所列的荧光激发/发射光波长，选择最适的激发/阻挡滤片组合。 2 FISH技术的发展原位杂交技术是Gall和Pardue(1969)分别发现的，利用放射性同位素标记的DNA探针检测细胞制片上非洲爪蟾细胞核内的rDNA[3,4]，当时是使用放射性同位素标记核酸用于原位杂交。随着分子克隆、同位素标记和核酸的化学合成技术的发展，在上世纪八十年代逐渐用非放射性半抗原如生物素进行核酸标记，虽然摒弃了放射性同位素，但方法繁琐、敏感度低、背景高[5]。1986年FISH技术问世，该法具有敏感度高、信号强、背景低、快速等优点[6,7]，因此得