大肠杆菌质粒转化.ppt

实验十一 、 大肠杆菌的质粒转化 转到目录 1. 实验目的 2. 实验原理 3. 实验仪器、材料与试剂 4. 实验步骤 5. 实验结果与分析讨论 一、实验目的 学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞和外源质粒DNA热激转化的方法。 感受态细胞 competent cell 细菌能从周围环境中吸收DNA的生理状态称为感受态。自然界中不是所有细菌都能进行自然转化，也不是生长的任何阶段都具有吸收DNA的能力，感受态的出现是由于细菌细胞表面出现许多DNA结合位点，这些位点只能与双链DNA结合，而不与单链DNA结合。 这说明完整的双链结构对于转化活性来说是必要的；DNA的进入和整合均为单链状态。 二、实验原理 转化效率决定于三个内在因素: ①受体细胞的感受态； ②受体细胞的限制酶系统，它决定转化因子在整合前是否被分解； ③受体和供体染色体的同源性，它决定转化因子的整合，因为转化因子总是与碱基序列相同或相近的受体DNA相配合，亲缘关系越近者同源性也越强。 二、实验原理 用于制备感受态细胞的大肠杆菌菌株应是限制-修饰系统缺陷的变异株，即限制性内切酶和甲基化酶活性缺陷的突变株。 大肠杆菌摄取DNA是非选择性的，而且可以用异源启动子启动转录和蛋白质合成，这使得大肠杆菌成为克隆实验的理想系统。 二、实验原理 大肠杆菌在0℃、CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的 DNA 形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收 DNA 复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。在被转化的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。 二、实验原理 CaCl2法的转化效率可达106-107转化子/μg DNA。 关键是(1)使用对数生长期的细菌； (2)低温操作。 优点: 简单、稳定、可重复性高。 缺点: 转化效率稍低，而且不能转化大质粒(＞15Kb) 二、实验原理 影响细菌转化效率的因素: 转化DNA的浓度、纯度和构型； 转化细胞的生理状态； 经CaCl2处理后的成活率； 转化环境：温度、pH、离子浓度等。 二、实验原理 克隆的筛选： 主要利用质粒上载有的抗生素抗性基因为筛选标记。常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等； 二、实验原理 三、实验器材与试剂 （一）实验器材 恒温摇床 、 培养箱、超净工作台、高压灭菌锅 、制冰机 、 低温离心机 、恒温水浴、（分光光度计），微量取液器、微型离心管等 （二）实验材料与试剂 菌株：E.coli DH5α 质粒：前一实验提取的质粒（pALEX）； 培养基：LB液体培养基；含抗菌素（氨苄青霉素，浓度50-100μg／mL。一般将抗生素配制成1000?储备液，用时按培养基的量再加入）的LB固体培养基； 预冷的CaCl2溶液（0.1mol／L）。 三、实验器材与试剂 重组DNA转化细菌过程示意图 取E.coli DH5α菌30ul，接种于LB液体培养基中 ↓37℃震荡（250rpm）培养过夜(12-16hs) 取过夜菌按1：50接种于新LB液体中，再震荡培养2.5-3hs ↓测OD600 达0.4-0.5时，停止培养 取菌液1.5ml，离心 ↓10 k rpm×10sec 倒干上清或用水泵抽干上清 ↓ 将沉淀菌体悬于750ul 预冷的0.1mM CaCl2溶液中 0℃×20min↓以下操作均在冰上进行，尽量快而稳 ↓4000rpm×4min，4℃，倒干 将沉淀菌体再悬于200ul预冷的0.1mM CaCl2溶液中 ↓ 四、实验步骤 ↓ +pALEX DNA 2-3ul（约1ng），轻弹管壁混匀 ↓0℃×30min ↓42℃×90sec ↓0℃×2min +800ul LB液体培养基，震荡恢复培养45m ↓ 涂LB平板（含Amp 60ug/