实验一 脯氨酸含量测定.doc

实验一 脯氨酸含量的测定 一、目的 了解脯氨酸与植物逆境、衰老的关系；掌握脯氨酸测定原理和常规测定方法。 二、原理 在正常环境条件下，植物体内游离脯氨酸含量较低，但在逆境（干旱、低温、高温、盐渍等）及植物衰老时，植物体内游离脯氨酸含量可增加10~100倍，并且游离脯氨酸积累量与逆境程度、植物的抗逆性有关。因此，测定植物体内游离脯氨酸的含量，在一定程度上可以判断逆境对植物的危害程度和植物对逆境的抵抗力。 在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，此缩合物在515nm处有最大吸收峰，可以用分光光度法测定。 三、实验材料，主要仪器和试剂 1．实验材料 植物组织。 2．主要仪器 （1）分光光度计 （2）水浴锅 （3）大试管（18mm×200mm） （4）具塞刻度试管（20mL） 3．试剂 （1）酸性茚三酮溶液：称取1.25g茚三酮溶于30mL冰乙酸和20mL 6M磷酸溶液中，搅拌加热（低于70℃）溶解，冷却后置棕色瓶中，4℃保存可使用2~3天。 （2）80%乙醇（分析纯）。 （3）脯氨酸标准溶液：称取10mg脯氨酸，用少量80%乙醇溶解，蒸馏水定容至100mL（100μg/mL）。再用蒸馏水释释成1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0μg/mL的系列溶液。 四、操作步骤 1．脯氨酸标准曲线制作 取7支具塞试管，分别加入各浓度的标准脯氨酸系列溶液2mL，冰乙酸2mL，茚三酮溶液2mL，混匀后沸水浴中加热20min，冷却后，以0号管为对照在515nm光波长下比色测定光密度。以光密度OD515nm为纵坐标，脯氨酸含量为横坐标，绘制标准曲线。 管 号 标准脯氨酸（μg） 冰乙酸（mL） 茚三酮溶液(mL) OD515nm 1 0 2 2 ? 2 1 2 2 ? 3 2.5 2 2 ? 4 5.0 2 2 ? 5 10 2 2 ? 6 15 2 2 ? 7 20 2 2 ? 2．样品制定 （1）称取0.2~0.5g植物样品放入研砵中，用总量为10mL 80%的乙醇（少许）研磨成匀浆，将匀浆移入大试管并用剩余80%乙醇洗研砵，试管加盖，黑暗下浸提1h（样品为绿色叶片时，应加入少许活性炭）。 （2）过滤上述提取液，并加1g人造沸石振荡15min，室温下离心3 000r/min、5min。 （3）取上清液2mL，加入2mL冰乙酸，2mL茚三酮溶液于大试管中，充分混匀，沸水浴加热20min，冷却后515nm波长下测定光密度。从标准曲线上查出待测样品中脯氨酸含量（μg）。 五、结果计算 脯氨酸含量（μg / g）= C×5 W 式中： C——由标准曲线查得的待测样品脯氨酸含量（μg） W——植物样品重量（g） 5——提取脯氨酸时80%乙醇体积（10mL）与测定时所取样品液体积（2mL）比。 六、思考题 1．植物组织内游离脯氨酸测定有何意义？ 2．脯氨酸提取除本实验方法外，还有何方法？测定时应作哪些改变？ 参考答案 1．在正常环境条件下，植物体内游离脯氨酸含量较低，但在逆境（干旱、低温、高温、盐渍等）及植物衰老时，植物体内游离脯氨酸含量明显增加。测定植物体内游离脯氨酸的含量，可以判断逆境对植物的危害程度和植物对逆境的抵抗力。 2．脯氨酸提取除本实验方法外，还可以用磺基水杨酸处理样品，待酸性茚三酮反应之后，再用甲苯萃取，520nm比色。当脯氨酸提取试剂或萃取剂改变时，测定光密度的波长应当改变，具体采用多少波长，还应根据实验而定。 ? 实验二 考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量 目的 学习和掌握考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量的原理和方法。 二、原理 考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。 二、材料、主要仪器和试剂 1．实验材料 新鲜绿豆芽 2．主要仪器 （1）分析天平、台式天平 （2）刻度吸管 （3）具塞试管、试管架 （4）研钵 （5）离心机、离心管 （6）烧杯、量筒 （7）微量取样器 （8）分光光度计 3．试剂 （1）牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取100mg牛血清白蛋白，溶于1