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用于Real-time PCR检测牛肉组织DNA提取方法探索 　　摘要：使用Ｃｈｅｌｅｘ－１００提取牛肉组织ＤＮＡ，并用紫外分光光度法检测所提取的ＤＮＡ浓度和纯度，结果表明所提取的ＤＮＡ Ａ２６０ ｎｍ / Ａ２８０ ｎｍ在１．６６２～１．８２６之间，纯度较高。Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ扩增提取的ＤＮＡ模板，表现出较高的敏感性。该ＤＮＡ提取方法效率较高，操作简便，能够获得较高质量的ＤＮＡ，适合检疫部门的快速检测需要。 　　关键词：ＤＮＡ；提取；Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ；牛肉组织 　　中图分类号：Ｑ９５３ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）05－1028-02 　　 　　Ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ of Ｂｅｅｆ Ｔｉｓｓｕｅs ＤＮＡ ｆｏｒ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ 　　 　　ＬＩ Ｊｉｎｇ１，ＣＨＥＮ Ｓｈｉ-ｊｉｅ２，ＣＨＥＮ Ｙａｎｇ１ 　　（１． Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｒｅｅｎ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｍａｔｅｒｉａｌ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｎｇｄｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｃｈｅｎｇｄｕ ６１００５９，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｓｉｃｈｕａｎ Ｅｘｐｏｒｔ ａｎｄ Ｉｍｐｏｒｔ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｂｕｒｅａｕ， Ｃｈｅｎｇｄｕ ６１００４１，Ｃｈｉｎａ） 　　 　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｃｈｅｌｅｘ－１００ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｂｅｅｆ ｔｉｓｓｕｅ． Ｔｈｅ ＤＮＡ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｔｈｅｎ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ ＵＶ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ Ａ２６０ ｎｍ / Ａ２８０ ｎｍ ｏｆ ＤＮＡ ｗａｓ １．６６２～１．８２６． Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｇｏｏｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ． Ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｏｆ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｓｉｍｐｌｅ， ｒａｐｉｄ ａｎｄ ａｂｌｅ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ＤＮＡ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｑｕａｌｉｔｙ， ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｂｙ ｉｎｓｐｅｃｔ ａｎｄ ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ． 　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ＤＮＡ； ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ； rｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ； ｂｅｅｆ ｔｉｓｓｕｅ 　　 　　肉类食品的安全直接关系到人类的健康，建立准确的动物源性成分检测方法非常重要［１，２］。实时定量ＰＣＲ（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）将荧光能量传递技术应用于常规ＰＣＲ中，具有高特异性和高灵敏性［３－５］。提取用于Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ检测的ＤＮＡ模板的方法很多，酚抽提法、异丙醇沉淀法以及甲酰胺裂解法是提取ＤＮＡ最为经典的方法，但不适用于仅有少量提取材料时［６］。另外，酚、氯仿等有机溶剂易造成环境污染，有损操作者的健康［７］。玻璃棒缠绕法用盐酸胍裂解细胞，这种方法简单快速，但对操作技术要求较高，盐析法用饱和氯化钠代替有机溶剂去除蛋白质，所获得的ＤＮＡ可以满足ＰＣＲ的要求，但产率相对较低［８］。用Ｃｈｅｌｅｘ－１００作为金属离子螯合剂提取ＤＮＡ，其原理是细胞在含有Ｃｈｅｌｅｘ－１００悬浊液中煮沸时，细胞膜破裂释放出ＤＮＡ，同时与二价金属离子螯合，可以避免ＤＮＡ在金属离子的催化作用下降解，从而获得纯度较高的ＤＮＡ［９，１０］。本实验采用该法提取牛肉组织ＤＮＡ，并将其应用于Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ检测，探索将该方法运用于动物检验检疫的可行性。 　　１ 材料与方法 　　１．１ 材料与仪器 　　４份新鲜牛肉均购自成都市农贸市场；溶液Ⅰ（含质量分数２０％的Ｃｈｅｌｅｘ－１００）；ＭＧＢ－Ｔａｑｍａｎ探针、细胞色素ｂ基因通用引物（引物１：５′－ＴＡＣＣＡＴＧＡＧＧＡＣＡＡＡＴＡＴＣＡＴＴＣＴＧ－３′，引物２：５′－ＣＣＴＣＣＴＡＧＴＴＴＧＴＴＡＧＧＧＡＴＴＧＡＴＣＧ－３′）订购自上海基康生物技术有限公司；实验仪器包括高速离心机、荧光定量ＰＣＲ仪、漩涡振荡器、核酸蛋白检测仪、均质仪等。 　　１．２ 实验方法 　　１．２．１ 牛肉组织ＤＮＡ的提取方法与步骤 称取新鲜牛肉５０ ｍｇ，加入５００ μＬ生理盐水，漩涡振荡１０ ｍｉｎ充分混匀，直至沉淀泛白。１３ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心５ ｍｉｎ，弃上清（若离心沉淀为红