稻瘟病新抗性基因Pita2候选基因表达载体构建.docVIP

稻瘟病新抗性基因Pita2候选基因表达载体构建 　　摘要：为了验证稻瘟病新抗性基因Ｐｉｔａ２的功能，利用长片段ＰＣＲ技术从基因的供体品种ＰｉＮｏ．４中扩增了２个候选基因Ｐｉｔａ２－１，Ｐｉｔａ２－２，长度分别为６．１ ｋｂ和１６．５ ｋｂ，电泳回收目的片段，然后利用双酶切分别克隆到植物表达载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３００。对阳性克隆通过菌落ＰＣＲ、酶切鉴定和测序分析，已成功地获得了２个候选基因的重组阳性克隆，为进一步研究Ｐｉｔａ２基因的功能奠定了基础。 　　关键词：稻瘟病；候选抗性基因；长片段ＰＣＲ技术；表达载体 　　中图分类号：Ｑ７８６文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）10－2133-03 　　 　　Construction of Expression Vector for Candidate Genes of New Rice Blast 　　Resistance Gene Pita2 　　 　　ＺＨＡＮＧ Ｊｉ－ｃｈｅｎｇ，ＺＨＡＮＧ Ｘｉａｎｇ－ｍｉｎｇ，ＷＡＮＧ Ｃｈｕｎ－ｔａｉ，ＬＩＵ Ｘｕｅ－ｑｕｎ，ＸＵ Ｘｉｎ，ＬＩＵ Ｘｉｎ－ｑｉｏｎｇ 　　（Ｋｅｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｔａｔｅ Ｅｔｈｎｉｃ Ａｆｆａｉｒｓ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ， Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｓｏｕｔｈ－Ｃｅｎｔｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｆｏｒ Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ， Ｗｕｈａｎ ４３００７４） 　　 　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｒｉｃｅ ｂｌａｓｔ ｉｓ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｄｅｖａｓｔａｔｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ ｒｉｃｅ， ａｎｄ ａ ｓｅｒｉｏｕｓ ｔｈｒｅａｔ ｔｏ ｒｉｃｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｎｅｗ ｒｉｃｅ ｂｌａｓｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｓｔｒａｔｅｇｙ． Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｇｅｎｅｓ Ｐｉｔａ２－１ ａｎｄ Ｐｉｔａ２－２， ｌｏｎｇ－ｒａｎｇｅ ＰＣＲ（ＬＲ－ＰＣＲ） ｗａｓ ｅｍｐｌｏｙｅｄ ｔｏ ａｍｐ???ｉｆｙ ｔｈｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｃｕｌｔｉｖａｒ ＰｉＮｏ．４． Ｔｈｅ ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ Ｐｉｔａ２－１（６．１ ｋｂ）ａｎｄ Ｐｉｔａ２－２（１６．５ ｋｂ） ｗｅｒｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｌｉｇａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｂｉｎａｒｙ ｖｅｃｔｏｒ ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｌｏｎｅｓ ｗｅｒｅ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｂｙ ｃｏｌｏｎｙ ＰＣＲ， ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ， ｔｈｕｓ ｌａｉｄ ａ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ Ｐｉｔａ２． 　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｒｉｃｅ ｂｌａｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ； ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ； ｌｏｎｇ－ｒａｎｇｅ ＰＣＲ； ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ 　　 　　稻瘟病是最具毁灭性的水稻病害之一，严重威胁着水稻的生产。相对于化学防治法的高成本和高污染，培育和合理利用抗病品种，是控制这一病害最经济和环保的方式手段［１，２］。由于稻瘟病菌生理小种的遗传复杂性及易变性，抗病品种常常推广种植几年后就丧失抗性［３，４］。发掘和创造具有广谱抗性的新抗源和抗性基因，是抗稻瘟病育种的主要研究方向。稻瘟病广谱新抗性基因Ｐｉｔａ２被定位于水稻第１２条染色体着丝粒区域一个大的基因簇内［５］。而这一基因簇包含了１４个已知的稻瘟病抗性基因，包括Ｐｉ２０、Ｐｉｔａ、Ｐｉｔａ２、Ｐｉ４、Ｐｉ６、Ｐｉ１２、Ｐｉ１９、Ｐｉ２１、Ｐｉ２４、Ｐｉ３１、 　　Ｐｉ３２、Ｐｉ１５７、Ｐｉｔｑ－６和Ｐｉ３９［６］。尽管Ｐｉｔａ已被克隆，并与相应的无毒基因间互作已在分子水平上得到了阐述［７］，但由于着丝粒区域的高度重复序列和抑制重组的特性，导致这一区域的研究进展缓慢。 　　开展稻瘟病广谱抗性基因Ｐｉｔａ２的克隆及功能研究，对加快着丝粒相关区段基因资源的开发和有效利用，以及新的抗性品种育成具有重要的应用价值，同时也对探讨抗性基因的起源及其进化的分子机理具有一定的参考价值。 　　１材料与方法 　　 水稻品种为携带Ｐｉｔａ