线蛱蝶亚科蝶类部分类群线粒体COI基因分子系统发生分析.docVIP

线蛱蝶亚科蝶类部分类群线粒体COI基因分子系统发生分析 　　摘 要：以线粒体细胞色素氧化酶I(COI)基因作分子标记，对线蛱蝶亚科蝴蝶进行序列测定，序列分析的结果表明，经比对和处理后的序列总长度是645 bp，其中有199个变异位点，147个简约信息位点；所编码的氨基酸序列中有18个变异位点，7个信息位点，A+T平均含量为69.6％，G+c平均含量为30.4％，碱基组成出现AT偏斜，以蛱蝶亚科及秀蛱蝶亚科物种为外类群，用NJ、MP及贝叶斯法重建了该亚科的系统发生树，探讨了它们主要类群间的系统发生关系，分子系统树显示，线蛱蝶亚科由以下3大支系：环蛱蝶族+翠蛱蝶族、线蛱蝶族、丽蛱蝶族构成；其中，环蛱蝶族为单系群(NJ树也支持线蛱蝶族的单系性)；翠蛱蝶族与环蛱蝶族亲缘关系较近：丽蛱蝶族可能是该亚科较早分化出的一支。 　　关键词：蛱蝶科；线蛱蝶亚科；COI，基因；分子系统发生 　　中图分类号：Q969.42 　　文献标识码：A 　　文章编号：1007.7847(2007)01-0064-08 　　 　　线蛱蝶亚科(Limenitinae)隶属于鳞翅目(Lepidoptera)蛱蝶科(Nymphalidae)，1864年由Behr建立，是蛱蝶科中较大的亚科之一，多数为中型或大型种类，主要分布在东洋区、新北区、古北区、新热带区、埃塞俄比亚区及澳洲区，按必威体育精装版的分类研究结果，全世界共有46个属808种左右，中国有其中的18个属共114个种，主要分布于我国南方的广大地区，和大多数蝶类一样，该亚科的形态学分类问题一直存在着争议，不同的研究者认为它们可能是一个多系群或并系群，线蛱蝶亚科的分子系统学等方面的研究在我国还是空白，国外的相关研究也十分少见， 　　蝶类所蕴含的多样性信息在无脊椎动物中是十分丰富的，并一直作为进化生物学和生态学研究的模型系统之一，随着分子生物学的迅速发展，多种DNA分析方法被用来研究不同类群、物种和种群间的遗传差异，其中线粒体基因是常用的目的基因，近十几年来，许多学者利用mtDNA(mitochondrial DNA)基因对昆虫纲内不同分类阶元之间系统发育关系进行了大量的研究，这些研究中所选取的目的基因，其中COI(cytochromeoxidase subnit I)基因的应用频率是较多的，目前，运用该基因研究蝶类的系统发生关系已有一些??导。 　　本研究测定了线蛱蝶亚科7属18种的线粒体COI基因部分序列，并从GenBank下载了该亚科4属4种的同源序列片段，通过该基因的比较和分析，重建该亚科的分子系统树，并据此探讨了该亚科的系统发生关系。 　　 　　1 材料与方法 　　 　　1.1 实验材料 　　本实验所用昆虫标本均为2005年采集的新鲜标本，样品采集后立即放入75％酒精中固定，带回实验室后放入-20℃冰箱保存，材料来源和时间见表1。 　　 　　1.2 基因组DNA的提取与扩增 　　采用蛋白酶K-玻璃粉法提取和纯化基因组DNA，具体方法参照Hao　et al，合成后生动物COI基因的一对通用引物，序列为： 　　L1490：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3′； 　　H2198：5′-TAAACTYCAGGGTGACCAAAAAAT-3′， 　　该引物可特异扩增mt DNA的COI基因(约650 bp)片断，引物合成由上海博彩生物技术有限公司完成。 　　PCR反应的总体积为50IxL，反应体系包括：10×buffer 5.0μL，25mmol/L的MgC12 7.0μL，0.2g/L的BSA 5.0IxL，0.25mmol/L的dNTPs1.25μL，10μmol/L引物各1.5μL，1.0U Taq酶及2μL(含10－25ng DNA)模板溶液，扩增条件为：94℃预变性5min，按下列参数进行35个循环：94变性1min，47℃退火1min，72℃延伸1min 30s，最后一个循环结束后，72℃总延伸10min，PCR产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，经纯化试剂盒纯化后，在ABI-377型测序仪上直接测序(由大连宝生物工程有限公司完成)。 　　 　　1.3 DNA序列数据处理及分子系统树的重建 　　对本研究测定了线蛱蝶亚科的18个种，并从GenBank上下载了该亚科4种、秀蛱蝶族2种及蛱蝶亚科一种的COI相应序列片断见表1，用Clustal X(1.8)软件该基因序列及氨基酸序列进行比对，基于Kimura-2－parameter模型，采用分子进化遗传分析软件Mega3.1计算不同序列间的可变位点、简约信息位点、转换颠换比值、对遗传距离及各碱基含量，由软件DAMBE分析序列间的不同特质，如不同密码子位点的转换与颠换比及转换、颠换和遗传距离之间的关系。