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结核杆菌Ag85B基因疫苗免疫保护效果研究 　　摘　要：为研究结核杆菌AJ95B基因疫苗的免疫原性和免疫保护效果，将雌性C57BL／6N小鼠32只，随机分为4组，即结核杆菌Ag85B基因疫苗组、BCC组、pcDNA3．1(+)组和PBS组。取各免疫组小鼠脾细胞培养上清检测细胞因子水平；同时进行CTL杀伤活性检测；进一步用结核杆菌H37Rv国际标准强毒株静脉注射攻击小鼠，计数肺和脾组织中的结核杆菌菌落数，对小鼠部分肺和脾组织作病理切片，HE染色观察组织病变程度，Z－N染色检查抗酸杆菌，观察该疫苗对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果。结果表明，结核杆菌Ag85B基因疫苗对小鼠结核杆菌感染有一定的免疫保护效果，能够诱导较强的抗原特异性Th1型细胞免疫应答，细胞因子IFN-y和IL-1分泌增加，IL-4分泌减少，CTL特异性活性增加；使小鼠肺和脾组织中的结核杆菌菌落数较空载体组显著减少，组织病变明显减轻。 　　关键词：结核杆菌；Ag85B；基因疫苗；免疫应答；免疫保护 　　中图分类号：Q78；R378 　　文献标识码：A 　　文章编号：1007-7847(2006)02―0128-06 　　近年来，随着人口流动的增加、结核杆菌多重耐药性菌株的出现以及结核病与艾滋病的伴发感染，结核病的疫情再度增高，给全球结核病的防治提出了新的挑战。降低结核病的患病率和死亡率，有效控制结核病，关键在于对结核病的有效预防。自1921年以来，卡介苗(BCG)就广泛应用于结核病的预防，大量的研究表明BCG对儿童原发性结核病具有较好的预防效果，但对结核病主要流行和传播形式的成人结核病，BCG的预防效果较差，因而研制和开发新型高效结核病疫苗对于结核病的有效控制具有十分重要的现实意义。本室构建了含结核杆菌Ag85B基因的真核表达质粒pcDNA3．1(+)-Ag85B能在体外成功表达相应抗原。在此基础上，进一步研究了其在小鼠体内诱导免疫应答的能力和对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果，旨在为研制新型结核病基因疫苗奠定基础。 　　 　　1 材料与方法 　　 　　1．1 材料 　　1．1．1 质粒、菌株和细胞 　　质粒pcDNA3．1(+)和宿主菌JM109均由本室常规保存；质粒pcDNA3．1(+)-Ag85B(含人结核分枝杆菌H37Rv株的Ag85B基因)由本室构建；结核杆菌H37Rv国际标准强??株有中国药品生物制品检定所提供；EL4／Ag85B细胞(H-2d)为转染pcDNA3．1(+)－Ag85B，并稳定表达Ag85B的EL4细胞。 　　1．1．2 主要试剂 　　去内毒素的质粒提取试剂盒(EndoFreePlas－mid Giga Kit)购自QIAGEN公司，TritonX-100、AMV一步法RT-PCR扩增试剂盒购自上海生工生物工程公司，Tripure试剂(Tripure lsolationReagent)购自Roche公司，乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒(LDH-Cytotoxicity Assay Kit)购自日本MBL公司，小鼠细胞因子IFN-y、Ⅱ-2、IL-4 ELISA检测试剂盒购自深圳晶美公司，BCG、结核菌素纯化蛋白衍生物PPD购自成都生物制品研究所。 　　1．1．3 实验动物 　　雌性C57BL／6小鼠，7～8周龄，体重：18―20g，构自中国医学科学院实验动物研究所。 　　1．2 方法 　　1．2．1 结核杆菌Ag85B基因疫苗的制备 　　按去内毒素的质粒提取试剂盒(EndoFreePlasmidGigaKit，QIAGEN公司)说明书提取和纯化去内毒素的pcDNA3．1(+)-Ag85B质粒，分光光度计检测A260进行核酸定量计算，A260260／A280比值检测核酸纯度$，用无菌PBS稀释成1000mg／L。 　　1．2．2 结核杆菌Ag85B基因疫苗免疫小鼠 　　32只C57BL／6健康小鼠，随机分为4组，即结核杆菌Ag85B基因疫苗组、BCG组、pcDNA3．1(+)组和PBS组，每组8只小鼠。在小鼠双侧股四头肌多点注射0．25％Bupivacaine 100μL小鼠肌肉变性第5d，于相应部位多点注射结核杆菌Ag85B基因疫苗100μg，以pcDNA3．1(+)质粒为阴性对照，PBS作为空白对照，每隔3周免疫1次，共3次。卡介苗组尾部皮下注射1μ106CFU卡介苗(BCG)1次，作为阳性对照。 　　1．2．3 免疫小鼠脾细胞分泌细胞因子的测定 　　第3次免疫后4周，每组处死3只小鼠，无菌条件下取出脾脏，分离脾细胞，细胞浓度5×106／mL，每种3个复孔，每孔中加入PPD(终浓度为1mg／L)，5％CO2孵箱中培养48h(IL-2测定)或72h(1L-4、IFN-y测定)后，收集脾细胞培养上清