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蛋鸡白血病PCR检测和序列分析 　　摘要：采用ＰＣＲ方法对某蛋鸡场送检感染鸡进行实验室诊断，针对禽白血病病毒逆转录酶 ３’区域设计鉴定内外源病毒共同下游引物 Ｈ５，针对ＡＬＶ－Ｊ亚群ｇｐ８５囊膜糖蛋白基因保守区域设计上游引物Ｈ７，Ａ－Ｅ亚群ｇｐ８５囊膜糖蛋白基因保守区域设计上游引物ＡＤ１，提取肝脏病料中核酸进行 ＰＣＲ扩增，测序分析结果表明为内源性禽白血病病毒感染。 　　关键词：禽白血病病毒（ＡＬＶ）；内源性白血病；ＰＣＲ鉴定；测序分析 　　中图分类号：Ｓ８５８．３１文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）14－2988-03 　　 　　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｔｙｐｅ ｏｆ Ａｖｉａｎ Ｌｅｕｃｏｓｉｓ Ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ by ＰＣＲ ａｎｄ 　　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ 　　 　　ＸＵ Ｑｉｎｇ－ｒｏｎｇ，ＷＡＮＧ Ｚｈｅｎ－ｂａｏ，ＷＡＮＧ Ｘｉ－ｌｉａｎｇ，ＸＩＡＯ Ｙｕｎ－ｃａｉ，ＺＨＯＵ Ｚｕ－ｔａｏ，ＣＵＩ Ｗｅｉ－ｔａｏ，ＢＩ Ｄｉｎｇ－ｒｅｎ 　　（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｕａzｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ ４３００７０，Ｃｈｉｎａ） 　　 　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Lａｂｏｒａｔｏｕｙ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ on ａｆｆｅｃｔｅｄ ｃｈｉｃｋｅｎ ｆｒｏｍ ａ ｌａｙｅｒ ｆａｒｍ was carried out by PCR． Tｈｅ ｃｏｎｇｅｎｅｒｏｕｓ ｄｏｗｎ ｐｒｉｍｅｒ Ｈ５ was ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ３’ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ of avian leucosis virus（ALV），Ｐｒｉｍｅｒ Ｈ７ ｗａｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｗｅｌｌ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｐ８５ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｊ ｓｕｂｇｒｏｕｐ； ａｎｄ ｐｒｉｍｅｒ ＡＤ１ ｗａｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｐ８５ ｏｆ Ａ－Ｅ ｓｕｂｇｒｏｕｐｓ． ＰＣＲ of the three pairs of primers was conducted using ｔｈｅ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｌｉｖｅｒ as ｓａｍｐｌｅ． Sequence analysis of PCR products ｐｒｏｖｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｉｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｗａｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｓｕｂｇｒｏｕｐ Ｅ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ａｖｉａｎ ｌｅｕｃｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ． 　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： aｖｉａｎ ｌｅｕｃｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ（ＡＬＶ）； ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｔｙｐｅ ｏｆ ａｖｉａｎ ｌｅｕｃｏｓｉｓ； ＰＣＲ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ； ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎａｌｙｓｉｓ 　　 　　禽白血病是由反转录病毒科Ｃ型反转录病毒属禽白血病／肉瘤病毒群病毒（ＡＬ／ＳＶ）所引起的禽类多种肿瘤性疾病的总称，其感染率高，发病率低［１］。是主要以造血细胞恶性增生为特征的一类传染病，包括淋巴细胞性白血病、成红细胞性白血病、成髓细胞性白血病、骨髓细胞瘤病等［２］。根据病毒中和反应形式、宿主范围、囊膜特性及其他标准将其划分为Ａ到Ｊ １０个亚群［３］，其中Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｊ亚群见于鸡。Ａ、Ｂ亚群为常见外源性病毒，主要感染商品蛋鸡，可引起淋巴白血病；Ｃ、Ｄ亚群是极少报道的外源性病毒；Ｅ 亚群为普遍存在的低致病性或无致病性的内源性病毒；Ｊ亚群由Ｓｍｉｔｈｓ等［４］于１９８８年首次从商品代肉用鸡中分离得到，而 Ｊ亚群是一由外源性白血病病毒与内源性Ｅ亚群病毒囊膜基因的重组体。本试验对湖北某鸡场送检鸡通过检测进行了确定性诊断，对致病毒株进行了分子生物学亚群鉴定，现将试验结果报道如下。 　　１材料与方法 　　１．１材料 　　１．１．１病料试验病料来源于湖北仙桃某蛋鸡场。 　　１．１．２仪器与试剂Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰ均购自宝生物工程（大连）有限公司（ＴａＫａＲａ）；Ｗｉｚａｒｄ??Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司。 　　１．２禽白血病病原核酸鉴定 　　１．２．１病料总 ＤＮＡ样本的提取取病料肝脏组织剪碎，然后与生理盐水按１∶（５~１０）比例进行组织匀浆，８ ５００ ｒ／ｍｉｎ 离心５ ｍｉｎ，使用 Ｐｒｏｍｅｇａ公司 Ｗｉｚａｒｄ??Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ提取送检血样白细胞 ＤＮＡ，操作步骤按试剂盒说明书进行。通过 ＵＶ－２１００