链霉菌H03发酵液中具有抗菌活性多糖分离纯化及其单糖组成分析.docVIP

链霉菌H03发酵液中具有抗菌活性多糖分离纯化及其单糖组成分析 　　摘　要：对链霉菌H03发酵产物进行了分离纯化，并对其进行了初步鉴定，对链霉菌H03发酵产物离心，采用减压蒸馏，乙醇沉淀，沉淀组分用Sevage法、盐析法去蛋白，用透析法除去小分子物质以及用Sephadex-100柱层析等技术进行纯化，纯化物质仍具有较强的抗菌活性，利用化学方法、紫外光谱、红外光谱、气质联用等方法分析该抗菌活性物质的理化性质，结果表明：从链霉菌的发酵产物中分离纯化得到的具有抗菌活性物质是多糖，这种多糖是由甘露糖、葡萄糖、半乳糖3种单糖组成的，其组成比例约为2:1:1。 　　关键词：链霉菌；多糖；分离纯化；气质联用 　　中图分类号：Q636.1　文献标识码：A　文章编号：1007－7847(2007)03－0212－06 　　 　　链霉菌是具有复杂生活周期的革兰氏阳性放线菌(actinoraycete)，在系统生物学上归于链霉菌属(Streptomyces)，该属的许多成员都能产生对人类具有重要意义的天然产物，如抗肿瘤剂、免疫抑制剂、抗虫剂以及淀粉酶、几丁质酶、纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶和蛋白酶等胞外水解酶，因此，近几十年来，关于链霉菌遗传、发育及代谢调控的研究倍受重视。 　　本实验室分离到一株链霉菌H03，该链霉菌发酵后产生一种非抗生素的大分子物质，这种大分子物质对多种植物病源真菌(如棉花枯萎病、小麦赤霉病菌、油菜菌核病、黄瓜炭蛆、甜菜褐斑、稻瘟病菌)、常见病源细菌(如大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌)具有较强的抗菌活性，为了更好地研究这种具有抗菌活性的大分子物质，本研究对这种链霉菌发酵产物中抗菌活性物质进行分离纯化，并对该物质进行了初步鉴定。 　　 　　1　材料与方法 　　 　　1．1　材料 　　链霉菌菌种由本实验室分离纯化并保存，Sephadex G-100(Phannacia公司)，标准单糖(生化试剂，亚法公司)，所有试剂均为分析纯， 　　种子和发酵培养基均选用液体培养基，培养基的组成为：蔗糖3％，豆饼粉3％，酵母浸膏0.2％，KH2PO40.2％，MgSO4?7H2O 0.1％，NaCl0.1％，(NH4)2SO4 0.04％，CaCO3 0.1％，初始pH7.2～7.4。 　　 　　1．2　方法 　　1．2．1　链霉菌的发酵 　　将菌??接种于种子培养基中，28℃振荡培养48 h后，以8％的接种量转种至B.Braun发酵罐(BIOSTATB，GERMANY)中，在发酵温度为28℃、搅拌转速为200r/min、通气量为2.0-3.0VVM条件下培养150h，此时生物活性最强、多糖产量较高，随即放罐，以8000r/min离心(RD-20Ⅲ，TOMY SEIKO CO.，LTD TOKYO JAPAN)发酵液20min得到上清液。 　　1．2．2　发酵液中活性物质的分离纯化 　　为了获得发酵产物中具有抗菌活性的物质，将上清液进行如图1所示工艺流程处理，并采用抑菌圈试验方法检测图1工艺流程中(1)～(12)编号对应的各种物质的抗菌活性，指示菌为金黄色葡萄球菌，其中，采用Sevage法去蛋白时，向浓缩液中加入等体积的Sevage试剂(氯仿：正丁醇：5:1(V/V))，最少重复6次，而采用硫酸铵盐析法时，缓隆向浓缩液中加入固体硫酸铵，使其饱和度达到100％，为了除去小分子杂质，将上清液用截留分子质量20000Da的透析袋(ψ36，武汉亚法公司)置于双蒸水中透析48h，透析袋中截留的溶液加入2倍体积95％乙醇，充分振荡，静置过夜，次日离心，得到沉淀和上清液。 　　将溶液(11)、(12)分别进行冷冻干燥后，各取50mg溶于2mL 0.1mol/L NaCl溶液中，充分溶解后进行柱层析，用Sephadex G-100装柱(75cm×3cm)，流动相为0.1mol/L NaCl水溶液，流速0.3mL/min，每管收集3mL，分部收集，用硫酸-蒽酮法检测，在620nm条件下比色，并以管号为横坐标，吸光度为纵坐标绘图，收集洗脱时主峰对应的溶液，进行冷冻干燥后，取少量配成浓度为2g/L的水溶液(分别记作13、14，并进行抑菌圈试验)，剩下的样品置于干燥器中保存、备用。 　　 　　1．2．3　链霉菌H03发酵产物的鉴定 　　1．2．3．1　化学方法鉴定 　　1)茚三酮反应 　　将2mg样品完全水解后定容至2mL，再取1mL该水解液于试管中，加茚三酮试剂1 mL，在沸水中加热20min，冷却后观察，分别取蒸馏水和小牛血清溶液(1.0g/L)1mL作为对照。 　　2)Molish反应 　　取1.0mL样品溶液(1.0g/L)于试管中，然后加2滴Molish试剂(α-萘酚)，摇匀，倾斜试管，沿管壁加入约1