黄孢原毛平革菌产木素过氧化物酶发酵条件优化.docVIP

黄孢原毛平革菌产木素过氧化物酶发酵条件优化 　　摘要：对白腐菌（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）产木素过氧化物酶的发酵条件进行了研究。在单因素试验的基础上用正交试验进行工艺参数的优化。结果表明，木素过氧化物酶的最佳培养条件为培养１３ ｄ、接种０．５ ｍＬ，料液比１∶２．５（Ｗ／Ｖ，ｇ∶ｍＬ）、培养温度２５℃，酶活为７７１ Ｕ／ｍＬ。 　　关键词：白腐菌 Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ；木素过氧化物酶；正交试验 　　中图分类号：Ｑ５５文献标识码： Ａ文章编号：0439－８114（２０11）11－2305-03 　　 　　Optimization of Production of Lignin Peroxidase by Phanerochaete chrysosporium 　　 　　ＷＡＮＧ Ｍｉｎ１，２，ＷＡＮＧ Ｊｉｅ２ 　　（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｈｅｎｇｓｈｕｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｈｅｎｇｓｈｕｉ ０５３０００，Ｈｅｂｅｉ，Ｃｈｉｎａ； 　　２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｅbｅｉ， Ｂａｏｄｉｎｇ ０７１００１，Ｈｅｂｅｉ，Ｃｈｉｎａ） 　　 　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｃｒａｆｔ ｏｆ ｌｉｇｎｉｎ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｂｙ ｗｈｉｔｅ－ｒｏｔ ｆｕｇｉ Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｗａｓ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ． Ｏｎ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ， ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ， ｔｈｅ ｔｉｍｅ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅ， １３ｄ； ｔｈｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ， ０．５ ｍＬ； solid to liquid ratio， 1∶25（W/V，g∶mL）ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒ??， ２５℃； ｌｉｐ ａｃｔｉｖｉｔｙ， ７７１ Ｕ／ｍＬ． 　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｗｈｉｔｅ－ｒｏｔ ｆｕｇｉ Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ； Ｌｉｇｎｉｎ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ； ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ 　　 　　白腐菌是已知的惟一能在纯系培养中有效地将木质素降解为ＣＯ２和Ｈ２Ｏ的一类微生物［１，２］，是迄今为止最有效、最主要的木质素降解微生物，在自然界的碳素循环中起着关键作用［３］。重要的木素降解酶有３种，木素过氧化物酶（Ｌｉｇｎｉｎ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＬｉＰ，ＥＣ．１．１１．１．７）、锰过氧化物酶（Ｍａｎｇａｎｅｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＭｎＰ，ＥＣ．１．１１．１．７）和漆酶（Ｌａｃｃａｓｅ，ＥＣ．１．１０．３．２）。ＬｉＰｓ是该酶系的主要成分，在木质素降解中起关键性作用。大多数白腐菌仅产生２种甚至１种分解木质素的酶［４－６］。木素降解酶不仅降解木质素，而且通过催化自由基链式反应，对环境中难降解有机污染物具有高效、广谱的降解功能。故利用白腐菌处理工业废水、生物制浆、土壤修复等是目前生物技术应用研究中的热点课题。对黄孢原毛平革菌分泌胞外酶的条件进行优化，旨在对白腐菌的工业化应用和生物质的高效利用提供一定的理论依据。 　　１材料与方法 　　１．１材料 　　甜高粱秸秆，于２００８年１０月取自河北农业大学标本园，经烘箱干燥后用中药粉碎机粉碎，过４０目筛，备用；黄孢原毛平革菌（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ），购自中国工业微生物菌种保藏中心；ＰＤＡ培养基： 去皮马铃薯２００ ｇ，加水１ ０００ ｍＬ煮沸３０ ｍｉｎ，滤去马铃薯，滤液补足至１ ０００ ｍＬ，葡萄糖２０ ｇ，琼脂１５ ｇ，１２１℃灭菌１５ ｍｉｎ。主要用于活化菌种；固态发酵培养基：甜高粱秸秆粉２０ ｇ，葡萄糖０．４ ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ０．０６ ｇ，水４０ ｇ，１２１℃灭菌１５ ｍｉｎ。 　　１．２方法 　　１．２．１不同发酵条件对木质素酶活影响的正交试验根据单因素试验，确定最佳水平。进行正交试验，因素与水平设计见表１。 　　１．２．２酶活测定粗酶液的制备：在秸秆发酵过程中，每２ ｄ取出２ ｇ发酵样品，加入缓冲液浸提，３０℃水浴振荡浸提１ ｈ。然后过滤，离心（３ ５００ ｒ／ｍｉｎ