乙肝病毒耐药基因测序ppt课件.ppt

对所有接受核苷类药物治疗的慢性乙型肝炎患者，治疗期间都应密切监测病毒学应答与突破，停药以后也应监测应答持续和病情复发情况 对初治无应答的患者，应考虑替换治疗以获得临床应答，尽可能减少后续耐药。对发生病毒学突破的患者，应考虑其依从性，同时尽可能进行病毒耐药突变的检测，以确定基因型耐药的存在和病毒耐药突变的模式。目前越来越多的患者接受一种以上药物治疗，对病毒耐药突变的检测显得尤其重要。 以上位点，现有测序试剂盒都可以检测。 拉米夫定（LAM） 阿德福韦（ADV） 恩替卡韦（ETV) 替比夫定（LDT) rtV173L rtL180M rtM204V/I/S rtV207I/L/G rtS213T rtA181V/T/S rtV214A rtQ215S rtN236T rtP237H rtN/H238T/D rtT184A/I/S rtS202G/I rtM204V/I/S rtM250L/V rtL180M rtM204V/I/S 目前常用的治疗乙肝口服抗病毒核苷类似物药物有：拉米夫定、替比夫定、阿德福韦、恩替卡韦四种。但是由于乙型肝炎病毒具有较高的突变性，一旦乙肝病毒发生耐药突变，将会导致上述药物治疗无效。研究结果显示，病人在治疗前就携带有拉米夫定耐药基因的有约26.41%，携带有阿德福韦耐药基因的有约6.52%。如果治疗之前就已经携带有这些耐药基因，在不明确的情况下使用了相关的药物，势必治疗效果较差。所以耐药基因测序检测不但是疗效考核的重要指标，更重要的是它是抗病毒药物选择的重要参考依据，避免盲目用药。 基因测序法的准确度与可靠性是其他方法不可替代的，它是基因耐药检测的“金标准”。乙肝病毒耐药基因测序结果能精确指导用药，确保抗病毒治疗取得最佳疗效。 乙肝病毒耐药基因测序的临床应用 ◆DNA测序技术原理 ◆乙肝耐药基因测序特点 ◆耐药基因测序的应用 DNA测序技术原理 乙肝病毒结构 美国ABI3130型基因测序仪 本实验采用核酸扩增技术结合荧光标记探针杂交方法对乙型肝炎病毒DNA进行定量检测，其产物经过测序PCR反应，产物纯化后上3130测序仪进行毛细管电泳，得到测序峰图，从而完成耐药突变位点的检测。 HBV DNA 的提取 定量PCR反应 （ HBV DNA ≥ 5×103 IU/ml 的标本可以进行测序） PCR产物的酶解（SAP酶混合物） 测序PCR反应 （双脱氧终止法） 测序产物纯化 （乙醇纯化法） 上机测序 （毛细管电泳） 测序峰图分析 乙肝病毒P区耐药基因测序步骤 双脱氧终止法原理 病毒DNA定量分析得到HBV DNA ≥ 5×103 IU/ml 的标本可以进行后续的耐药基因测序 ，定量PCR产物经过SAP MIX的纯化后，进行测序PCR反应。 普通PCR与测序PCR反应的比较 普通PCR 测序PCR反应 （双脱氧终止法） DNA 聚合酶 Taq 酶 测序酶 引物 一对 单向 底物 dNTP dNTP+ddNTP(带荧光标记) 产物 等长的DNA片段 相差一个碱基的一系列片段 荧光标记 无 3’端带荧光标记 SAP MIX的作用 外切酶Exon I 降解定量PCR产物中残留的单链PCR引物。SAP酶除去定量PCR产物中残存的脱氧核苷三磷酸的磷酸基团，从而达到纯化定量PCR产物的目的。 经过SAP MIX 酶解纯化后的定量产物方可以进行后面的测序PCR反应。 测序PCR循环条件 96℃ 1min → (96℃ 10sec , 50℃ 5sec , 60℃ 4min) ×25 cycles →4℃恒温。 60℃ 4min的延伸时间是与普通PCR最大差别，目的是为了扩增出一系列相差一个碱基的ddNTP末端终止的DNA序列。 测序反应得到的产物经过酒精纯化，甲酰胺变性之后，可以上机进行毛细管电泳。 酒精纯化的目的是去除未结合的荧光染料终止物和残留的引物、盐离子、酶等。此步对测序成功非常关键，关系到测序峰图质量的好坏。 毛细管电泳原理 一、电进样与电泳 毛细管和电极深入样品溶液中，加电压，荷负电的DNA分子进入毛细管，在电场作用下向阳极泳动。 二、荧光激发和检测 带4色荧光标记的DNA片段按分子量从小到大依次经过激光检测区，激光激发荧光，产生长波长的荧光信号，荧光信号被CCD收集，软件将光学信号转换成电泳图谱。 HBV野生型质控的测序峰图