药学分子生物学RNAi大课讲解材料.ppt

第六章 常用分子生物学技术;一、基因敲除的一般原理;外源DNA与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，从而代替受体细胞基因组中的相同或相似的基因序列，整合入受体细胞的基因组中。;;基因敲除技术与诺贝尔奖;1. 基因敲除载体的构建;基因敲除载体应具备以下特点： ;常用的筛选标记为正负筛选：Neo（新霉素磷酸转移酶）基因阳性筛选标记和HSV-tk（单纯袍子病毒 胸腺嘧啶激酶）基因阴性筛选标记。;（基因敲除载体的构建 Step1. 获得目的基因（待敲除基因）的同源片段，将此DNA片段克隆到一般质粒中； Step 2. 从重组质粒中切除目的基因的大部分同源序列，只留部分序列在线性质粒载体的两端； Step 3. 将neo基因和HSV-tk克隆到质粒中；; 根据载体与靶基因组同源序列双链断裂位点位置的不同，基因载体通常分为两种： 1．插入性载体(gene-insertion vector) 　　 2．置换型载体(gene-replacement vector) 大多数的基因敲除中，采用的是置换性载体；而插入性载体则更多的应用于基因敲入和对目的基因的精确突变。; 2.基因敲除载体导入ES细胞 ; 基因敲除载体导入ES细胞; 基因敲除载体导入ES的方法有显微注射法，电穿孔法，DEAG葡聚糖介导法，脂质体法，病毒感染法，精子载体法等;3.筛选与鉴定; a.正负双向筛选系统（PNS）： Nero基因表达，ES细胞抗新霉素，在G418的培养 基中存活。 HSV-tk基因表达，在更昔洛韦的培养基中，ES细胞 被杀死。; b.正向筛选 又称标记基因的特异性表达法，仅有正性选择性标记的标记基因，而且这种标记方法是缺乏自身的某个表达调控序列。 标记基因因为特异整合，获得调控序列，能够表达。 可以分为无启动子筛选法， 无增强子筛选法， 无poly（A）筛选法。 ;c．物理筛选方法 主要是PCR筛选方法，优点是灵敏，专一性强；。 此外还有富集或筛选率比较高时，可以用Southern blot杂交法， ; 4.基因敲除动物的产生 ; 导入动物胚胎后，可以发育成嵌合子或完全ES来源的动物。 嵌合体动物与正常的动物杂交，子代动物再杂交，有可能产生杂合型突变体。;得到纯合体： 由于同源重组常常发生在一对染色体上中一条染色体中,所以如果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，需要进行至少两代遗传。;二、基因敲除的应用;3.基因敲除和转基因技术为人类疾病的基因治疗提供有力手段。 使用基因工程技术将外源基因导入患者的病变细胞，纠正机体基因缺陷或调节基因表达功能是细胞重新获得正常的功能，这个过程称为基因表达。 4.基因敲除和转基因技术通过改造生物体基因，可以用于研制优良的生物反应器，培育新的生物品种和提供异种器官移植的供体动物。;随着基因敲除技术的发展，早期技术中的许多不足和缺陷都已经解决，但基因敲除技术始终存在着一个难以克服的缺点，即敲掉一个基因并不一定就能获知该基因的功能， 其原因包括： 一方面，许多基因在功能上是冗余的， 敲掉一个在功能上冗余的基因，并不能造成容易识别的表型，因为基因家族的其他成员可以提供同样的功能； 另一方面，对于某些必需基因，敲除后会造成细胞的致死性，也就无法对这些必需基因进行相应的研究了。 ;C基因敲除小鼠胚胎致死 D基因敲出小鼠胚胎不致死,C基因和D基因双敲除之后 小鼠与D一样 胚胎不致死.C和D之间是什么关系吗？ ;第六章 常用分子生物学技术;一、RNAi的发现 二、 RNAi的作用机制 三、 RNAi的作用特点 四、siRNA的设计与制备 五、RNA干扰的生物学意义及在药学中的应用;RNAi（RNA interference，RNA干扰）;梅洛(Craig Mello)生于1960年，是被恐龙骨引入科学世界的。梅洛童年时经常跟着父亲在美国西部寻找化石。从那时起，他就迷上了远古时代、地球历史和人类生命的起源等问题。高中时代，梅洛的兴趣逐渐转移到了基因工程方面。;Gene Expression;;;一、RNA干扰的发现 ;一、RNA干扰的发现 ;一、RNA干扰的发现 ;1998年，Andrew Fire等首次将正义链反义链RNA混合注入线虫C.elegans中，观察到更强的基因表达抑制。首次提出了RNA interference