酶工程4 第五篇 章 酶的化学修饰.ppt

第五章 酶的化学修饰;第一节 什么是酶分子修饰?;酶分子的化学修饰;酶分子改造的方向;酶分子的化学修饰定义：;酶化学修饰的原理 一、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性 修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成多点交联。使酶的天然构象产生“刚性”结构。 二、如何保护酶活性部位与抗抑制剂 大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶的活性部位。;三、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶 酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶： 大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子。“遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。 2. 酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。;四、如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境 1. 酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成 了共价键。 破坏了抗原决定簇——抗原性降低乃至消除 “遮盖”了抗原决定簇——阻碍抗原、抗体结合 2. 大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表面形成“缓冲外壳”，抵御外界环境的极性变化，维持酶活性部位微环境相对稳定。;第三节 酶化学修饰的基本要求和条件 ;一． 修饰剂的要求; 了解被修饰酶的性质 酶的稳定性：包括热稳定性、酸碱稳定性，作用温度以及pH，酶蛋白解离时的电化学性质，抑制剂的性质等。 酶活性中心的状况：包括酶分子活性中心的组成，如参与活性中心的氨基酸残基、辅因子等。酶分子的形状、大小以及寡聚酶的亚基组成。;①pH与离子强度： 一般在酶稳定的条件下进行，尽可能减少破坏酶的必需集团，选择酶与修饰剂的结合率和酶活回收率都较高的反应条件。 pH决定了酶分子中反应基团的解离状态，酶的解离状态不同，其反应性能也不同；另一方面，有些修饰试剂在不同pH下，与同一种基团反应可以形成不同的产物。离子强度对修饰反应也有重要影响。 ②修饰反应的温度与时间：严格控制反应温度和时间可以减少或消除一些非专一性的修饰反应。 ③反应体系中酶与修饰剂的比例：酶与修饰试剂的比例可以控制酶分子的修饰程度。;(1)酶的表面修饰 (2)酶分子的内部修饰 (3)与辅因子相关的修饰 (4)金属酶的金属取代 ;⑦反相胶团微囊化;（1）酶的表面修饰 ①化学固定化：一般是直接通过酶表面的氨基酸残基将酶分子共价连接到惰性载体上；由于载体的引入，使酶所处的微环境发生改变，进而改变了酶的性质，特别是动力学性质发生了改变。;②酶的小分子修饰作用：主要是利用一些小分子修饰试剂，通过共价结合来修饰酶的一些基团（如-COO-、-NH3+、-SH、-OH、咪唑基等），提高酶的稳定性。常用的小分子修饰试剂有乙基、糖基和甲基等。 例如:将α—胰凝乳蛋白酶表面的氨基修饰后，酶的热稳定性在60℃时，提高了1000倍，温度更高时稳定化效应更强烈。这个稳定的酶能经受灭菌的极端条件而不失活，因而有利于医疗用酶。;③酶的大分子修饰作用：可分为非共价修饰和共价修饰两大类：;大分子非共价修饰： 利用一些大分子试剂通过与酶非共价相互作用，对酶进行有效的保护。 例如聚乙二醇、右旋糖苷等通过氢键固定于酶分子的表面，同时又有效地与外部水相连，从而保护酶的活力； 一些多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来保护酶活力； 另外一些蛋白质可以通过相互作用，排除分子表面的水分子，降低介电常数，使酶的稳定性增加。;大分子共价修饰： 利用一些可溶性大分子，通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层，形成的可溶性酶具有许多有用的性质。 例如用聚乙二醇共价修饰超氧化物歧化酶（SOD），不仅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了半衰期，从而提高了药效。;大分子（共价）修饰的过程;③修饰 将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液，以一定的比例混合，在一定的温度、pH值等条件下反应一段时间，使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价键结合，对酶分子进行修饰。 ④分离 需要通过凝胶层析等方法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。;④分子内交联： 增加酶分子表面的交联键数目是提高酶稳定性的有效方法之一，例如胰凝乳蛋白酶上的羧基经过羰二亚胺活化后，可以与一系列二胺发生作用，使酶的稳定性得到改善。; ⑤分子间交联： 利用一些双功能或多功能试剂将不同的酶交联在一起形成杂化酶。例如用戊二醛把胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶交联在一起，可以降低胰凝乳蛋白酶的自溶性；将胰蛋白酶与碱性磷酸脂酶交联形成的杂化酶可作为部分代谢途径的模型。;⑥脂质体包埋：一些医药用酶，如 SOD、溶菌酶等，由于分子量较大，不易进入人体细胞内，而且在体内半衰期短，产生免疫原性反应；用脂质