sars冠状病毒核衣壳蛋白对细胞色素氧化酶cyp450cyp4f3a酶活性影响的研究-effect of nucleocapsid protein of sars coronavirus on cytochrome oxidase cyp 450 cyp 4f 3a enzyme activity.docx

摘 要SARS 冠状病毒核衣壳蛋白对细胞色素氧化 酶 CYP450(CYP4F3A)酶活性影响的研究 摘要核衣壳蛋白（N 蛋白）是 SARS 冠状病毒(SARS-CoV)的主要结构蛋白之一， 与病毒 RNA 结合形成核衣壳，能够诱导强烈的细胞免疫和体液免疫，在 SARS 的诊断和预防上具有重要的应用。与其它冠状病毒 N 蛋白不同，SARS-CoV N 蛋白定位于细胞质，参与 SARS 冠状病毒 RNA 合成的调控以及核衣壳的形成。 并且，SARS-CoV N 蛋白能结合人亲环素(hCypA)解离病毒核心，激活 AP-1 信号 转导途径，从而干扰宿主细胞分裂，在生长因子缺乏的情况下诱导细胞凋亡。前 期工作发现 N 蛋白可能在 SARS 冠状病毒感染过程中起重要作用。为了研究 SARS-CoV N 蛋白参与炎症反应的分子机理，以全长 N 蛋白为诱饵蛋白，利用酵母双杂交筛选人胎肝 cDNA 文库时，发现细胞色素 P450（CYP4F3A）与 SARS-CoV N 蛋白相互作用。CYP4F3A 是炎症反应过程中重要的调节蛋白，其 相互作用很可能与 SARS 病毒的致病性相关。本研究建立了 CYP4F3A 在体外的酶促反应体系及其动力学常数测定方法， 并通过一系列离子交换层析、分子筛凝胶过滤层析、免疫沉淀、免疫印迹以及 ELISA 证明，SARS-CoV N 蛋白与 CYP4F3A 结合可以抑制 CYP4F3A 的 ω-羟化酶活性，从而抑制炎症因子 LTB4 的降解。N 蛋白在体外抑制 CYP4F3A 的酶活， 使其 Km’值从 2.5μmol/L 变为 10.2μmol/L，而加入 229E N 蛋白后 Km’仅变化为 4.82μmol/L。我们发现通过尾静脉注射 N 蛋白在 LPS 诱导小鼠炎症模型中起促 进炎症反应的作用。Silybin 是从植物水飞蓟中提取的黄酮类化合物，具有抑制5-酯氧酶的作用，从而间接阻断了 LTB4 的合成。当在 LPS 注射前 1h 给予药物 Silybin，LTB4 浓度比未给药组低。说明 Silybin 可以通过阻断炎症介质的生成来 保护 LPS 诱导产生的急性肺损伤。并且，当肌肉注射表达 N 蛋白的质粒并腹腔 注射 LPS 的小鼠血清中 LTB4 水平与对照组相比升高。将质粒与 MDP-C（胞壁SARS 冠状病毒核衣壳蛋白对细胞色素 P450(CYP4F3A)酶活性影响的研究肽佐剂）一起通过静脉免疫家兔，动物产生显著的过敏样反应。小鼠和家兔肺部及肠道中性粒细胞浸润，部分动物表现为肺水肿，这些症状与 SARS 临床表现类 似。本研究为 SARS 致病机理的进一步研究提供了重要线索。关键词：SARS-CoV N 蛋白；CYP4F3A；LTB4；Cyp4f18；HCoV-229E N 蛋白； 酶促反应动力学；米氏常数；抑制常数；ELISAABSTRACTThe effects of SARS-CoV nucleocapsid protein on the catalytic activity ofCytochrome P450(CYP4F3A) AbstractNucleocapsid protein is one of the major structural proteins of SARS-CoV，Which is known to bind viral RNA to form the helical nucleocapsid. Also, Nucleocapsid protein of SARS-CoV is the major immunogenic antigen which was capable of generating strong humoral and cellular immune responses, suggesting an important application of SARS N protein in SARS diagnosis and prevention. The SARS N protein was shown to play important roles such as regulation of SARS-CoV RNA synthesis and nucleocapsid formation, disassembly of the viral core by binding to human cyclophilin A, and activation of AP-1 signal transduction pathway, which interferences host cell division and induces apoptosi